Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin Amato

1. Ação do hormôniotireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do fator de necrosetumoralalfa Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin Amato

2. Tecidos Eixohipotálamo-hipófise-tireoide Hipotálamo Hipófise Tireoide T4 + T3 Circulação Tecidos

3. Efeitosfisiológicos do hormôniotireoidiano • Desenvolvimento • Homeostase • Proliferação e diferenciaçãocelular SistemaNervoso Central Funçãoreprodutiva SNC SNC Consumo de oxigênio Frequênciacardíaca Temperatura corporal Atividade de outros hormônios Metabolismode nutrientes

4. Mecanismo de ação do hormôniotireoidiano - T3 Histonas desacetiladas Transcrição + T3 Histonas acetiladas

5. Deficiência x excesso de hormôniotireoidiano HIPERTIREOIDISMO • Taquicardia • Pele quente e úmida • Hiperglicemia • Hipocolesterolemia • Aumento da taxa metabólica basal HIPOTIREOIDISMO • Bradicardia • Pele ressecada e fria • Hipoglicemia • Hipercolesterolemia • Redução da taxa metabólica basal

6. Hipotireoidismo x doença cardiovascular • Hipotireoidismofrancoe aparelho cardiovascular •  frequência e contratilidadecardíaca •  expressão de genes quecodificamenzimasqueregulamcontratilidade e relaxamentocardíaco • Thyroid hormone and the cardiovascular system: from theory to practice. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78:1026. • Biochemical basis of thyroid hormone action in the heart. Am J Med 1990; 88:626.

7. Hipotireoidismo x doença cardiovascular • Hipotireoidismosubclínico e aparelho cardiovascular •  incidência de doença aterosclerótica •  mortalidade cardiovascular • Subclinical hypothyroidism is an independent risk factor for atherosclerosis and myocardial infarction in elderly women: the Rotterdam Study. Ann Intern Med 2000: 132:270. • Risk for ischemic heart disease and all-cause mortality in subclinical hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3365. • Subclinical hypothyrodism is associated with a low-grade inflammation, increased triglyceride levels and predicts cardiovascular disease in males below 50 years. Clin Endocrinol (Oxf) 2004; 61:232. • Impaired endothelium-dependent vasodilation in subclinical hypothyroidism: beneficial effect of levothyroxine therapy. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:3731

8. Por que o hipotireoidismoaumenta o risco de doença cardiovascular? •  resistência vascular periférica  piora de hipertensão arterial sistêmica • Hipercolesterolemia • Hiperhomocisteinemia Doença cardiovascular aterosclerótica x inflamação sistêmica O hormôniotireoidiano e seu receptor poderiaminfluenciar o processoinflamatório?

9. Háoutrascondiçõesquecompartilhamalterações do eixo HHT e alteraçõesinflamatórias?

10. Síndrome do T3 baixo • Funçãotireoidiana em doençasnãotireoidianas •  T3 • TSH normal oubaixo • Correlação T3 e marcadoresinflamatórios • Association between serum interleukin-6 and serum 3,5,3’-triiodothyronine in nonthyroidal illness. J ClinEndocrinolMetab 1993;77(6):1695–9. • Relationship of the increased serum interleukin-6 concentration to changes of thyroid function in nonthyroidal illness. J Endocrinol Invest 1994;17:269–74. • Role of cytokines in the pathogenesis of the euthyroid sick syndrome. Eur J Endocrinol 1998; 138:603–14. • Relating circulating thyroid hormone concentrations to serum interleukins-6 and -10 in association with non-thyroidal illnesses including chronic renal insufficiency. BMC EndocrDisord 2008;8:1.

11. Insuficiênciacardíaca • Correlaçãonegativa T3 x IL-6, TNF- e proteína C reativa P < 0,05, r = -0,14 T3L > 2 T3L < 2 Controle T3L (pg/mL) TNFa (pg/mL) • Relationship between triiodothyronine and proinflammatory cytokines in chronic heart failure. Biomedicine & Pharmacotherapy 2010; 64:165-169.

12. Doença renal crônica • Funçãotireoidianana doença renal crônica •  T3 • TSH normal, T3 reverso normal • Correlação T3 x marcadoresinflamatórios (IL-6, TFN-alfa)e sobrevida • Clinical and biochemical implications of low thyroid hormone levels (total and free forms) in euthyroid patients with chronic kidney disease. J Intern Med 2007; 262:690–701. • Low triiodothyronine: a new facet of inflammation in end-stage renal disease. J Am SocNephrol 2005; 16: 2789–2795. • Low triiodothyronine and survival in end-stage renal disease. Kidney Int 2006; 70:523–528. • Subclinical hypothyroidism is linked to micro-inflammation and predicts death in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transplant 2007; 22:538–544.

13. Hormôniotireoidiano x inflamação T3 Inflamação Relaçãocausa – efeito? Direcionalidade?

14. Receptores Nucleares • O que são? • Uma superfamília  48 genes  75 proteínas • São complexos de sinalização que atuam de várias maneiras, modulando a ativação e a repressão de sinais.

15. Ligante Ligação ao ligante Transativação Ligação ao DNA Dobradiça (Hinge) Domínio carboxi - terminal Domínio amino - terminal A/B C D E F LBD AF - 1 DBD

16. Mecanismo de ação do hormôniotireoidiano - T3 Histonas desacetiladas Transcrição + T3 Histonas acetiladas

17. Modelo de estudo • Fator de necrosetumoralalfa (TNF-) Inflamação sistêmica Macrófagos e monócitos Indução de apoptose e inibição de tumorigênese Receptor de membrana Adipócitos, célulasmesangiais Inibição da replicação viral Doençashumanas Resistência insulínica, síndrome metabólica, doença cardiovascular aterosclerótica

18. Objetivo • Objetivo Geral: • Estudar o efeito do T3 e de seu receptor sobre a atividade transcricional no promotor do gene do TNF-α e esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na regulação desse gene. • Objetivos Específicos: • Estudar o efeito do T3 na regulação da atividade transcricional do receptor do hormônio tireoidiano no promotor do gene do TNFα. • Estudar o efeito das diferentes isoformas de TR (TRα e TRβ). • Avaliar a importância da interação direta de TR com o promotor do TNFα. • Avaliar o efeito do T3 na síntese de proteína TNFα.

19. LUC Construções de plasmídeosrepórterescontendopromotor do TNF (inteirooufragmentos) -1044 +93 -125 LUC -82 LUC TNF RE (-125/-82) 3X TK LUC

20. Receptor 1 mcg + (-1044)TNF-Luc 4 mcg 175 b b 150 a 125 a vetor vazio a 100 a Taxa de ativação a TR alfa 75 TR beta c LBDTR beta 50 25 0 - - - - + + + + T3 100 mM TR e (-1044) TNF-Luc Células U937 -1044 +93 LUC

21. Transfecção • O que é? • Introdução de moléculasexógenas em células • DNA plasmidial • Em geral, a transfecção é seguida pela expressão de um ou mais genes presentes no DNA introduzido • Ensaio de gene repórter • Métodos • Precipitação do fosfato de cálcio • Lipossomos • Eletroporação

22. Ensaio Gene Repórter • Pra que serve o ensaio? • Para estudar a expressão dos genes • Avaliando o efeito de uma seqüência regulatória de um determinado gene • O que podemos realizar com o ensaio? • Delimitar os elementos regulatórios • Avaliar os efeitos de agentes hormonais • Estudar impactos em mutações gênicas

23. Procedimento Processos: Lavagem (PBS 1x); Tripsina (0,5%); DMEN inibir a Tripsina Centrifugar: 5 min a 2000 rpm.

24. Procedimento Pellet: células Sobrenadante: meio de cultura • Suspensão das célulasemsoluçãotampão • (PBS, cálcio, glicose)

25. DNA plasmidial TR TRE-luciferase + 500 L suspensão de células (10 x 106 células) 500 L /cuveta (10 x 106 células) 950 F e 0,3 kV Misturadasuspensão de célulasao DNA plasmidial Transferênciadasuspensão de células + DNA plasmidialparacuvetas de 0,4 cm Eletroporação

26. 1 mL/poço T3 10-5M Ressuspensão das célulaseletroporadasemmeio de cultura Distribuiçãodasuspensão de célulasemplacas de 12 poços e tratamentos T3 10-6M T3 10-7M Veículo

27. 37oC e 5% CO2 24h Avaliação da expressão do gene repórter Luminômetro 10 μL do lisado celular + 10 μL do substrato da enzima luciferase

28. Células U-937 -1044 +93 LUC

29. Células U-937 -1044 +93 LUC

30. LUC Células U-937 -1044 +93 -125 LUC -82 LUC TNF RE (-125/-82) 3X TK LUC

31. LUC Células U-937 -1044 +93 -125 LUC -82 LUC TNF RE (-125/-82) 3X TK LUC

32. O TR interagediretamente com o promotor do TNF-? • Ensaio de anisotropia de fluorescência wtTNFRE (CACTACCGCTTCCTCCAGATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCAAG) + DBD-TR

33. Próximospassos… L422R (Mutante do TR beta – Leucina 422 trocada por uma Arginina) – diminuição da capacidade de dimerização • Ensaios de gene repórter com mutantes do TRb • Papel da dimerizaçãonarepressãodo promotor do TNFa: L422R • Papel da superfície de interação com correpressores narepressão do promotor do TNFa: G345R e F451X. • Avaliação da expressão do TNFa em respostaaotratamento com T3 • Cultura de células: célulasmesangiaishumanas • Interação TR e promotor do TNFa in vitro (gel shift) G345R (Mutante no domínio de Ligação ao Ligante – LBD – Glicina 355 trocada por uma Arginina) – perda da afinidade do TR ao T3, não afetando ligação de dímeros ao TREs. F451X (Mutante TR beta – 10 ultimosaaapartir da Fenilalanina 451, foram deletados – Hélice 12 foi eliminado, superfície de ligação ao correpressor foi exposta. )

34. Obrigado!!!