Informe sobre la Observación de Microbiomas Bacterianos

1. “Año de la recuperación y consolidación de la economía peruana" UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL DOCENTE Dr. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL ALUMNOS ROMERO CESPEDES, JOSEPHY JORGE CÓDIGO: 2022205006 TURPO ESPINOZA, ALEXIS FABIAN CÓDIGO: 2022205018 CICLO: VII FECHA: 21/04/2025 ILO – PERÚ

2. OBSERVACIÓN DE MICROBIOMAS BACTERIANOS PROVENIENTES DE FUENTES ANIMALES Y VEGETALES I. INTRODUCCIÓN Imagina adentrarte en el fascinante mundo invisible que nos rodea. En la Universidad Nacional de Moquegua, la Microbiología Ambiental no es solo una asignatura más, sino una ventana hacia el universo microscópico que sostiene la vida en nuestro planeta, este se dedica al estudio de los microorganismos que pueblan los distintos compartimentos del planeta ya sean suelo, agua o aire y su influencia en la dinámica de los ecosistemas. Estos microorganismos (bacterias, hongos, protozoos, arqueas) son motores de los ciclos biogeoquímicos, promotores de la fertilidad de suelos, biodescomponedores de contaminantes y moduladores de la salud de plantas, animales y humanos. Estamos hablando de estudiar los pequeños gigantes que habitan el suelo donde pisas, el agua que bebes y el aire que respiras. Estos diminutos seres bacterias, hongos, protozoos son verdaderos héroes silenciosos: reciclan nutrientes en los ciclos biogeoquímicos, hacen que nuestras tierras sean fértiles, limpian contaminantes y tienen un papel crucial en la salud de todo ser vivo, desde las plantas hasta nosotros mismos. En este curso, combinaremos lo mejor de dos mundos, técnicas tradicionales como la tinción y observación microscópica, junto con métodos para entender cómo funcionan estas comunidades microbianas en diferentes ambientes. La práctica que estás a punto de comenzar es una auténtica aventura científica donde no solo observarás microorganismos, sino que también reflexionarás sobre cómo las condiciones químicas y físicas de cada muestra determinan qué nutrientes están disponibles y cómo estos pequeños seres pueden prosperar en tales condiciones

3. II. OBJETIVOS Objetivo general Observar si la diversidad y abundancia de microorganismos (bacterias, hongos y protozoos) presentes en muestras de origen humano, alimentario, vegetal y edáfico, presentan diferencias en sus propiedades. Objetivos específicos Evaluar si existe presencia de microorganismos en cada muestra por tinción y microscopía. Analizar si las razones de su presencia o ausencia se deben a factores de la muestra como compuestos antimicrobianos, humedad, nutrientes, etc. III. MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS 3.1. Materiales: Láminas portaobjeto: 15 por grupo Láminas cubreobjeto: 10 por grupo Hisopos estériles (cotonetes) Pipetas graduadas y puntas estériles Muestra de boca humana Yogurt comercial Gloria Raíz de rábano Raíz de cebolla Aceituna Suelo agrícola (50g de un parque público) Pasa seca 3.2. Reactivos: Agua destilada: 500mL Reactivo cristal violeta: 1 frasco Alcohol etílico al 70%: 1L 3.3. Equipos: Microscopio compuesto (objetivos 4×, 10×, 40×, 100×) IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Muestra de boca Durante la práctica de laboratorio comenzamos etiquetando los portaobjetos limpios y preparamos hisopos estériles .luego recogimos la muestra bucal, con un hisopo estéril frotamos suavemente la mucosa interna de la boca, procurando cubrir toda la

4. superficie, luego colocamos el hisopo en la lámina portaobjeto que previamente estaba con una gota de agua destilada, a continuación, se colocó un poco de reactivo cristal violeta y se procedió a cubrir con la lámina cubreobjeto, si esta lamina se encontraba manchada u opaca por alguna razón se procedía a utilizar un poco de alcohol al 70% junto a papel tisú para la correcta limpieza de este, finalmente, llevamos la muestra al microscopio y seguimos el procedimiento de observación, comenzamos con el objetivo 4× para localizar la zona teñida, continuamos con 10× para captar estructuras generales y concluimos con 40× para detallar los elementos presentes. Yogurt Comercial Gloria De igual manera que la muestra anterior, para esta muestra, etiquetamos portaobjetos limpios y utilizamos un isopo estéril para tomar exactamente la muestra de yogurt Gloria. De esta forma en el portaobjetos colocamos una gota de agua destilada y luego incorporamos la muestra de yogurt, mezclándola suavemente hasta obtener una película uniforme. Dejamos que la preparación se secara un poco al aire. Una vez la cantidad de agua disminuyera un poco, aplicamos.únicamente cristal violeta como un agente de tinción y esperamos un tiempo para que la tinción surgiera efecto. Enseguida, colocamos la lámina cubreobjetos y , finalmente, la muestra fue llevada al microscopio donde comenzamos observando con el objetivo 4×, luego 10× y finalmente 40× para una apreciación más detallada de las estructuras bacterianas. Raíz de Rábano Primero seleccionamos raíces de rábano que fueron adquiridas en un mercado, las limpiamos con un paco de agua estéril para remover partículas gruesas como la tierra y las secamos con papel tisú o papel estéril. Mi compañero y yo cortamos aproximadamente un tramo de tejido radicular y ,es de esta manera que en un portaobjetos limpio colocamos una gota de agua destilada, y con una pinza añadimos una pequeña porción de la raiz obtenida, mezclando ligeramente para lograr una extensión uniforme, y procedimos observar la muestra al microscopio comenzando con 4× para localizar la región, continuando con 10× para generalidades y finalizando con 40× para observar morfología bacteriana y otras estructuras como protozoos móviles. Cebolla Tomamos la muestra de cebolla limpia y fresca, la enjuagamos con agua destilada estéril y la secamos con papel estéril. Luego procedimos a retirar algunas capas y

5. tomamos una parte de la cebolla, luego procedimos a colocar una muy fina capa del tejido sobre el portaobjetos, por otro lado, colocamos una gota de agua destilada en un portaobjetos y agregamos la parte de la cebolla que previamente sacamos para observar, extendiéndola cuidadosamente para lograr una capa delgada. Una vez humedecida, cubrimos con el cubreobjetos, luego procedimos a observar la muestra en el microscopio, siguiendo la secuencia de enfoque: primero con 4×, luego 10× y finalmente 40×. Aceituna Seleccionamos una aceituna, y con una tijera le hacemos un pequeño corte, luego con este corte de muy poca masa de pulpa la machacamos para hacer q la aceituna se suelte y poder esparcir la muestra de mejor manera, después en un portaobjetos limpio colocamos una gota de agua destilada, y luego agregamos parte de la aceituna, extendiéndola cuidadosamente. Tras esto, procedimos a colocar el cubreobjetos y finalmente la muestra fue llevada al microscopio y observada con el objetivo 4×, luego 10× y por último 40× para examinar detalles más finos. Pasa Seca Al igual que la aceituna tomamos un poco de la superficie de una pasa seca, luego, trituramos la parte cortada del fruto, mientras tanto en un portaobjetos colocamos una gota de agua destilada y luego una pequeña porción de la suspensión, la cual fue extendida con cuidado, finalmente, se puso el cubreobjetos y la lámina fue observada con el microscopio en secuencia de objetivos 4×, 10× y 40× para apreciar con mayor detalle las estructuras presentes. Suelo Agrícola (Parque) Recolectamos 50g de suelo superficial de un parque, es así que en el laboratorio colocamos una gota de agua destilada sobre un portaobjetos y luego agregamos una pequeña cantidad del suelo, y extendimos de manera uniforme, finalmente, observamos la muestra al microscopio, iniciando con el objetivo 4×, luego 10× y terminando con 40×.

6. V. RESULTADOS Muestra de Boca Humana Al observar la lámina teñida sólo con cristal violeta, detectamos una densa población de bacterias adheridas y esparcidas junto a células epiteliales desprendidas de la mucosa. Las bacterias aparecieron en diversas morfologías (cocos y bacilos) y las células epiteliales reconocibles como estructuras poligonales claras con núcleos más oscuros. Células epiteliales Bacterias de la pared bucal Yogurt Comercial Gloria La preparación con cristal violeta reveló abundantes agregados bacterianos, organizados en cadenas y grupos densos. No pudimos distinguir especies, pero la alta concentración confirma la sólida presencia de cultivos probióticos en el producto. Bacterias en cadena Bacterias aglomeradas

7. Raíz de Rábano En la muestra sin tinción vimos, además de bacterias tal vez bacilos dispersos, protozoos móviles con flagelos claramente activos, se movían con rapidez entre las bacterias. Bacterias bacilos protozoos Cebolla Tras extender, no apareció ninguna bacteria visible. La lámina mostró sólo restos vegetales, así como las células vegetales y el fondo despejado, sin agentes microbianos vistos. Célula vegetal Aceituna

8. Bajo el objetivo sólo se apreciaron gotitas refractantes (lipídicas) y una ausencia casi total de bacterias. Incluso en zonas con restos de pulpa apenas surgían, se vio la mayor presencia de lípidos. lípidos Pasa Seca Encontramos estructuras filamentosas ramificadas (hifas fúngicas) y esporas redondeadas, junto a una presencia poca o nula de bacterias. Esporas hifas ramificadas

9. Suelo Agrícola (Parque) Lo único que distinguimos al microscopio fueron partículas inorgánicas: granos de arena fina y motas de arcilla. No detectamos bacterias ni otras células microbianas sobre la preparación. Limo, arena y arcilla

10. VI. CONCLUSIONES Muestra de Boca Humana El análisis de la muestra de mucosa bucal mostro mucha diversidad microbiana activa, observable mediante la tinción con cristal violeta, y bajo el microscopio, se identificaron múltiples formas bacterianas, predominantemente y posiblemente cocos y bacilos, que se encontraban tanto adheridas a células epiteliales humanas como dispersas en el campo visual. De esta manera se evidencia la complejidad del ecosistema oral, en el cual coexisten diversos géneros bacterianos que colonizan las superficies mucosas. La presencia de bacterias unidas a las células sugiere la formación de biopelículas, un mecanismo clave que favorece la supervivencia frente a factores antimicrobianos presentes en la saliva, como lisozimas, defensinas y el pH ligeramente ácido del entorno. La coloración obtenida sin necesidad de tinciones adicionales indica no solo una alta densidad microbiana, sino también una fuerte afinidad de las células y las bacterias por el cristal violeta, facilitando su identificación. Estos resultados se alinean con lo documentado en investigaciones previas, las cuales destacan que el ambiente húmedo, cálido y rico en nutrientes del interior bucal favorece una colonización microbiana estable y persistente. Desde otro enfoque, la cavidad bucal funciona como un punto de contacto entre el ambiente externo y el organismo, y su microbiota participa activamente en funciones defensivas e inmunológicas, también la variedad morfológica observada sugiere una diversidad funcional significativa, que abarca desde bacterias beneficiosas hasta posibles patógenos, es de esta forma q la mucosa bucal actúa como un nicho microbiano de alta riqueza biológica, influenciado por factores internos como el pH, el tipo de epitelio entre otros factores. Yogurt Comercial Gloria El estudio de la muestra del yogurt comercial Gloria reveló una gran cantidad de bacterias organizadas en formas agregadas, en cadenas y en grupos, claramente visibles con la tinción de cristal violeta. Esta disposición indica la presencia activa de cultivos probióticos, que son incorporados deliberadamente durante la producción para aportar beneficios a las personas que consumen estos productos. Aunque no fue posible identificar géneros específicos mediante la tinción usada, las formas observadas coinciden con las características de bacterias ácido-lácticas como Lactobacillus y Streptococcus, habituales en procesos de producción de yogurt. La buena conservación de las estructuras celulares, sumada a su abundancia, sugiere que estas bacterias estaban

11. vivas o en un estado reciente de actividad metabólica. De la misma manera se sabe que la base semisólida del yogurt proporciona un entorno óptimo, rico en compuestos como lactosa, péptidos y vitaminas, que estimulan el crecimiento y la estabilidad de estos microorganismos, y además, el pH ácido del producto impide el desarrollo de otros microorganismos indeseables, reforzando la exclusividad de esta microbiota. También podemos decir que, el yogurt representa un ecosistema cerrado y controlado, donde predomina una diversidad reducida pero beneficiosa, y el hecho de que se lograra visualizar fácilmente estos microorganismos bajo el microscopio, sin técnicas complejas, indica una biomasa significativa y una alta calidad en el proceso de fermentación industrial. Raíz de Rábano Entre las muestras analizadas, la raíz de rábano resultó especialmente interesante por su riqueza biológica ya que este fue adquirido en un mercado de la zona, en el análisis microscópico, se detectaron bacterias en forma de bacilos entre otros y, de forma destacada, protozoos móviles, un indicador directo de actividad biológica en la muestra. La presencia de estos organismos sugiere que el tejido del rábano ofrecía condiciones propicias o ideales como humedad y nutrientes disponibles para tener tanto vida microbiana procariota como eucariota. La movilidad observada en los protozoos apunta a un estado de conservación adecuado del vegetal, probablemente gracias a su frescura y a la retención de agua en su interior. El hecho de que estas formas vivas fueran visibles sin necesidad de tinción sugiere un alto grado de actividad metabólica. En cuanto a las bacterias, su presencia podría corresponder a una colonización natural de la raíz, ya sea en la superficie (epifítica que es algo que crece sobre otra planta, pero no la parasita ni se alimenta de ella) o en el interior del tejido (endofítica), como ocurre comúnmente en vegetales frescos. Estas bacterias pueden cumplir funciones beneficiosas, como facilitar la absorción de nutrientes o actuar como barrera frente a patógenos. También es posible que la microbiota vista refleje restos del ambiente de cultivo, como partículas del suelo o material orgánico, es por eso que esta muestra demuestra la existencia de un microbioma activo y diverso, donde la coexistencia de distintas formas de vida microbiana evidencia la importancia de los vegetales como hábitats vivos en el contexto agrícola o simplemente para las plantas.

12. Cebolla Al examinar la muestra de tejido de cebolla, no se observaron indicios de actividad microbiana bajo el microscopio. No se detectaron bacterias ni hongos, y el campo visual mostró únicamente estructuras vegetales, presumiblemente células epidérmicas de la cebolla, de esta manera y sin elementos que sugirieran la presencia de microorganismos vivos,la ausencia puede explicarse por las propias propiedades bioquímicas de la cebolla, que es conocida por contener compuestos azufrados como la alicina y otros derivados sulfurados con acción antimicrobiana, por este motivo estas sustancias pueden interferir con funciones vitales en los microorganismos, tales como la síntesis de proteínas, la integridad de la membrana celular o los procesos de replicación del ADN, reduciendo su viabilidad o impidiendo su colonización, también debemos señalar que la capa seleccionada para el análisis fue tomada del interior del bulbo, una región menos expuesta al medio ambiente y, por tanto, menos propensa a albergar comunidades microbianas. Además, el bajo contenido de agua libre en las capas más internas contribuye a generar un ambiente poco favorable para la proliferación de bacterias o levaduras y aspecto relevante fue la preparación previa de la muestra, que incluyó la limpieza de la tierra en la muestra, reduciendo aún más la posibilidad de contaminación externa , y es por eso que se ve el rol defensivo de los metabolitos secundarios de la cebolla, que actúan como barrera natural frente a microorganismos que podrían ingresar a la planta. Aceituna La vista microscópica de la muestra de aceituna no reveló la presencia de bacterias u otros microorganismos, pero sí mostró múltiples estructuras refractantes que, por su aspecto, corresponden probablemente a glóbulos lipídicos ya q se vio una especie de pequeñas burbujas brillantes, por ese motivo hallazgo es consistente con la composición del fruto, que contiene una elevada composición de aceites vegetales,y en particular ácidos grasos como oleico y linoleico, por ese motivo estas sustancias no solo dominan la estructura interna de la aceituna, sino que también crean un entorno poco propicio para el desarrollo microbiano, debido a su capacidad para limitar la disponibilidad de agua libre, un requisito esencial, fundamental para la mayoría de los microorganismos, tambien, las aceitunas contienen compuestos fenólicos, como la oleuropeína, que poseen propiedades antimicrobianas reconocidas, de eta manera estos compuestos afectan la permeabilidad de las membranas celulares microbianas y pueden interferir con procesos enzimáticos cruciales y la ausencia de microorganismos en esta muestra puede deberse a

13. que muchas aceitunas son procesadas industrialmente mediante tratamientos en salmuera o con conservantes, lo cual puede alterar significativamente su microbiota original, y como dijo el docente en el laboratorio, este fenómeno tiene implicancias tanto para la seguridad alimentaria como para el estudio de microbiotas en alimentos procesados. Pasa Seca El análisis de la pasa seca permitió identificar claramente estructuras fúngicas, incluyendo hifas ramificadas y esporas como pequeños puntos azules, visibles con nitidez al microscopio. A diferencia de otras muestras, no se evidenció la presencia de bacterias, lo que sugiere una dominancia de hongos xerófilos (esaquel que puede sobrevivir y reproducirse en ambientes con muy baja disponibilidad de agua) en esta matriz alimentaria, de esta manera las pasas, al ser frutas desecadas, presentan un ambiente con baja actividad de agua, lo cual favorece selectivamente a microorganismos adaptados a condiciones de escasa humedad. Este tipo de hongos, como los pertenecientes a los géneros Aspergillus o Penicillium, pueden sobrevivir y desarrollarse en medios con alto contenido de azúcares y limitada disponibilidad hídrica, de la misma manera la abundancia de esporas observadas indica que estas colonias se encuentran en una fase activa de crecimiento, lo cual es relevante desde el punto de vista de la seguridad alimentaria, también la escasez de bacterias puede explicarse no solo por el entorno deshidratado, sino también por la competencia microbiana, ya que los hongos suelen ocupar rápidamente el nicho ecológico disponible, inhibiendo el desarrollo de otros grupos, y también debemos considerar que se suman posibles tratamientos postcosecha como la exposición al sol o la utilización de sulfitos que afectan más severamente a las bacterias que a los hongos resistentes finalmente nuestra muestra analizada demostro cómo un entorno con baja humedad selecciona de forma natural una microbiota particular, dominada por organismos capaces de persistir en estas condiciones. Suelo Agrícola (Parque Público) Durante el análisis microscópico de la muestra de suelo agrícola obtenida en un parque público, no se logró observar presencia alguna de bacterias, hongos ni otros microorganismos. En el campo visual solo se identificaron componentes inorgánicos, como granos minerales y partículas de arcilla, por este motivo y talvez este resultado, lejos de indicar una ausencia real de vida microbiana, refleja más bien las limitaciones técnicas del procedimiento utilizado, por que en contraste en muestras de suelo, muchos microorganismos se adhieren con fuerza a las partículas sólidas, o bien forman

14. biopelículas que no se disgregan fácilmente en agua sin el uso de agentes dispersantes, ultrasonido o técnicas de enriquecimiento, de esta manera además, la microscopía óptica, sin técnicas de tinción especializadas, ofrece un contraste limitado entre el fondo y las células microbianas, lo cual dificulta su detección directa. Otro factor por considerar es la posible baja concentración de materia orgánica en la zona del suelo recolectada, lo cual puede traducirse en una densidad microbiana insuficiente para ser visualizada sin métodos más sensibles. También influyen las condiciones del parque, como el tránsito peatonal o la compactación del terreno, que pueden alterar negativamente la estructura y funcionalidad microbiana del suelo así como si se usan agua con altos contenidos de cloro , de esta manera el resultado resalta la necesidad de aplicar métodos complementarios y más sensibles cuando se trabaja con matrices complejas como el suelo y este experimento muestra cómo la metodología empleada puede afectar profundamente la percepción del contenido biológico real de un entorno natural.

15. VII. BIBLIOGRAFIA Pradeep, A. R., & Sharma, B. (2001). Diagnostic Utility of Gram Stain for Oral Smears – A Review. Journal of Oral Pathology & Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10679832/ Nayak, P., & Shashidhar, V. (2023). Oral Commensals in Healthy Individuals: A Clinicocytological Study. Journal of Cytology & Histology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC11344192/ Kumar, A. R., & Reddy, V. (2023). A Protocol for Assessing the Adhesion Potential of Lactic Acid Bacteria to Buccal Epithelial Cells. Journal of Microbiological Methods. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC11848468/ Dubus, D., et al. (2018). Yogurt Starter Cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus: Characterization and Functional Properties. Journal of Dairy Research, S0022030218309652. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030218309652 Zhang, Q., & Li, R. (2024). Unveiling the Probiotic Potential of Streptococcus thermophilus MCC0200: In Vitro and In Silico Insights. BMC Microbiology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10891967/ Patrauchan, M. A., et al. (2015). Streptococcus thermophilus Biofilm Formation: A Remnant Trait of Environmental Adaptation. Scientific Reports, 5, 10531. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4452758/ Marschner, P., et al. (2017). The Role of Soil Microorganisms in Plant Mineral Nutrition—Current Knowledge and Future Directions. Frontiers in Plant Science, 8, 1617. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5610682/ Xiao, K., & Wang, X. (2022). Rhizosphere Bacteria in Plant Growth Promotion, Biocontrol, and Bioremediation. Frontiers in Microbiology, 12, 8509026. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8509026/ López-Mondéjar, R., et al. (2020). Tailoring Plant-Associated Microbial Inoculants in Agriculture. Frontiers in Microbiology, 11, 7450670. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7450670/

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