实验六放线菌的形态观察

实验六放线菌的形态观察 庞昕山东大学微生物技术国家重点实验室

一、目的要求 1. 掌握配制合成培养基的一般方法。 2.学习并掌握观察放线菌形态的基本方法。 3 .初步了解放线菌的形态特征。

二、基本原理——培养基 高氏 I 号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏 I 号培养基中的FeSO4·7H2O的量只有0.00l ％，因此在配制培养基时需预先配成高浓度的 FeSO4·H2O贮备液，然后再按需加入一定的量到培养基中。

二、基本原理——放线菌 • 放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝 ( 简称“基丝” ) ，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝 ( 简称“气丝” ) ，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。 • 在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。 • 为了观察放线菌的形态特征，入们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验介绍扦片法。

二、基本原理——扦片法 • 扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。

三、实验器材 • 1 菌种：青色链霉菌 ( S glaucus ) ，弗氏链霉菌 ( S. fradiae ) 。 • 2 培养基：高氏 1 号琼脂。 • 3 仪器或其他用具：平皿、玻璃纸、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，石炭酸复红染液，显微镜等。

高氏 I 号培养基 配方如下：可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO 3 1g K2HPO4· 3H2O 0.5g MgSO4 ·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 琼脂 15~ 25g 水 1000ml pH 7.4~7.6 1. 称量和溶化按配方先称取可溶性溶粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分 FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在 100ml 水中加入 lg 的 FeSO4·7H2O配成 0.01 g /ml ，再在 1 000ml 培养基中加 1m 1 的 0.01 g ／ ml 的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 2. pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检验四、操作步骤 ——培养基制备

四、操作步骤——扦片法 (1) 倒平板取融化并冷至大约 50 ℃ 的高氏 1 号琼脂约 20ml 倒平板，凝固待用。 (2) 接种用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。 (3) 扦片以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约 45 °角扦入琼脂内 ( 扦在接种线上 )( 图 IV — 7) ，扦片数量可根据需要而定。 (4) 培养将扦片平板倒置， 28 ℃ 培养，培养时间根据观察的目的而定，通常 3~5d 。 (5) 镜检用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。如果用 0.1% 美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。

四、操作步骤——关键步骤及注意事项 • 1.倒平板要厚一些，接种时划线要密。 • 2.插片时要有一定角度并与划线垂直。 • 3.观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。 • 4.如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。

五、实验报告 1 结果绘图说明你所观察到的放线菌的主要形态特征。 2 思考题 (1) 试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点。 (2) 玻璃纸培养和观察法是否还可用于其他类群微生物的培养和观察，为什么？ (3) 镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝

实验六 放线菌的形态观察