Etude des relations structure/fonction d’une bactériocine anti- Listeria ,

2. Etude des relations structure/fonction d’une bactériocine anti-Listeria, la mésentéricine Y105 Equipe de Microbiologie fondamentale et appliquée CNRS-FRE 2224, Université de Poitiers Directeur: Pr Jacques Frère

3. Les bactériocines • Synthèse ribosomique • Produites par des bactéries • Spectre antagoniste généralement étroit • Immunité • Deux groupes suivant le producteur: • - Gram négatif • - Gram positif (bactéries lactiques)

4. Les bactériocines des bactéries lactiques • Applications potentielles: clinique, alimentaire, vétérinaire, cosmétique • Classification sur critères physico-chimiques

5. Classification des bactériocines de bactéries lactiques (d’après Klaenhammer, 1993) • Classe I: Lantibiotiques • Petits peptides modifiés (nisine) • Classe II: Peptides thermostables non modifiés • IIa: anti-Listeria • IIb: deux composants • IIc: autres peptides (Eijsink et coll., 2002) • Classe III: Protéines thermosensibles • Classe IV: Complexes • Existence controversée (Nes et coll., 1996)

6. Bactériocines de la sous-classe IIa: caractères physico-chimiques • Peptides cationiques • Thermorésistants • Taille réduite (37 à 48 résidus)

7. hélice a pont disulfure feuillet b COOH NH2 épingle à cheveux Fregeau-Gallagher et coll., 1997 Bactériocines de la sous-classe IIa: structure • Non structurés dans l’eau • Structurés dans environnement mimant la membrane

8. 1 10 20 30 40  KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAFSAGVHRLANGGNGFW KNYGNGVHCTKKGCSVDWGYAWTNIANNSVMNGLTGGNAGWHN KYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWSK KYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKS KYYGNGVHCGKHSCTVDWGTAIGNIGNNAAANWATGWNAGG ARSYGNGVYCNNKKCWVNRGEATQSIIGGMISGWASGLAGM KYYGNGVSCNKNGCTVDWSKAIGIIGNNAAANLTTGGAAGWNKG AISYGNGVYCNKEKCWVNKAENKQAITGIVIGGWASSLAGMGH VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGINSFVSGVASGAGSIGRRP TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQAAGGIGQTVVxGWLGGAIPGK ATYYGNGLYCNKQKCWVDWNKASREIGKIIVNGWVQHGPWAPR ATRSYGNGVYCNNSKCWVNWGEAKENIAGIVISGWASGLAGMGH KYYGNGVTCGLHDCRVDRGKATCGIINNGGMWGDIG KYYGNGVSCNSHGCSVNWGQAWTCGVNHLANGGHGGVC KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGTHKC TTHSGKYYGNGVYCTKNKCTVDWAKATTCIAGMSIGGFLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC KYYGNGVTCGKHSCSVNWGQAFSCSVSHLANFGHGKC KYYGNGLSCSKKGCTVNWGQAFSCGVNRVATAGHGKx KSYGNGVHCNKKKCWVDWGSAISTIGNNSAANWATGGAAGWKS KYYGNGLSCNKSGCSVDWSKAISIIGNNAVANLTTGGAAGWKS TSYGNGVHCNKSKCWIDVSELETYKAGTVSNPKDILW YGNGV C C V W A X> 80%,X < 80% Mésentéricine Y105 Leucocine A Leucocine C Mundticine Mundticine KS Sakacine P Curvacine A Piscicoline 126 Carnobactériocine BM1 Carnobactériocine B2 Bavaricine MN Bactériocine 31 Entérocine P Bifidocine B Sakacine G Pédiocine PA-1 Coaguline Entérocine A Divercine V41 Plantaricine 423 Plantaricine C19 Listériocine 743A Sakacine 5X Lactococcine MMFII Consensus Bactériocines de la sous-classe IIa: spectre d’activité • Bactéries proches phylogénétiquement • Genre Listeria et espèce Enterococcus faecalis • Autres bactéries à Gram positif

9. inducteur protéine kinase immunité ABC-transporteur régulateur de réponse protéine accessoire prébactériocine Bactériocines de la sous-classe IIa: organisation génétique • En général, déterminants génétiques sur un plasmide

10. Protéine accessoire Extérieur Membrane Intérieur N C ADP + Pi ATP Transport et maturation Bactériocine mature • Système de transport dédié (DTS) • ABC-transporteur et sa protéine accessoire • Hélices transmembranaires • Deux domaines cytoplasmiques: • - hydrolyse ATP • - maturation • Leader à doublet de glycines Peptide leader prébactériocine D’après Simon, 2001

11. A B A. Modèle “en douve de tonneau” ou “barrel-stave”. B. Modèle ”en tapis” ou ”carpet”. (Bechinger, 1999) Bactériocines de sous-classe IIa: mode d’action (1) • Modèles proposés • Intervention d’un récepteur? • PTS mannose (Dalet et coll., 2001; Gravesen et coll., 2002)

12. Bactériocines de sous-classe IIa: mode d’action (2) • Partie N-terminale • - consensus YGNGV • - charges positives • - feuillet b • - premier pont disulfure

13. Bactériocines de sous-classe IIa: mode d’action (3) • Partie C-terminale • - hélice a centrale • - épingle à cheveux • - second pont disulfure • - rôle des tryptophanes

14. I26V* A22F* Christian Lacombe, communication personnelle Notre modèle: la mésentéricine Y105 (1) Héchard et coll., 1992 * Résidus dans la leucocine A • Peptide de 37 résidus, PM= 3868 • Leuconostoc mesenteroides Y105 • Séquence proche de celle de la leucocine A • Active contre bactéries des genres Listeria, Leuconostoc, Lactobacillus, Carnobacterium, Pediococcus et Enterococcus

15. protéine accessoire immunité pré-MesY105 ABC-transporteur pré-MesB105 ? immunité? Héchard et coll., 1999 Notre modèle: la mésentéricine Y105 (2) • Deux opérons sur le plasmide pHY30

16. Préambule • Objectif: étude des relations structure/fonction • Condition: obtenir une collection de MesY105 modifiées • Moyens à mettre en œuvre: • - système efficace de production de peptides • - protocole mutagenèse adapté • - caractérisation des dérivés obtenus

17. XmnI/DraI PstI pDMYC02 Ptaq mat-mesY Site de clivage du polypeptide par le facteur Xa malE Production des bactériocines: protéines de fusion • Fusion Maltose Binding Protein (MBP)::MesY105 • Avantages: • - E. coli: bactérie facile à manipuler • - rendements de production importants • - système inductible • - purification rapide •  Mauvais rendement lié à un clivage inefficace XmnI mesY DraI PstI PstI mat-mesY malE LacZ pMal-C2 6,6 kpb (New England Biolabs) pDMYC01 3,1 kpb pGEM-T 3 kpb

18. Utilisation du système de transport dédié à MesY105 • Expression chez Leuconostoc (Ln.) mesenteroides • Avantages: • - bactérie relativement facile à manipuler • - bactériocine mature • - sécrétion • - purification facilitée •  Système de production adéquat

19. Leader Terminateur RBS PmesYI mesI mesY pFBYC04 PmesCDE mesB-part PmesYI EcoRI EcoRI LacZ mesC mesD mesE mesF mesH mesI mesY EcoRI LacZ apR PmesCDE pDMJF01 pDMJF:YI 6,4 kpb mesB-part PmesYI mesC mesD mesE mesF mesH mesI ori apR ori Expression par Ln. mesenteroides: système à deux plasmides pFBYC04 EcoRI EcoRI • pDMJF01: transport et maturation • pDMJF:YI: MesY105 et immunité •  Immunité mais pas MesY105 • Les deux plasmides simultanément •  Sécrétion de MesY105 mesI pMK4 mesY

20. PmesCDE pDMJF01 mesB-part PmesYI mesC mesD mesE mesF mesH mesI PmesCDE PmesCDE mesB-part PmesYI PmesYI pFBYC04 pDMJF03 mesC mesD mesE mesF mesH mesC mesD mesE mesI mesY Expression par Ln. mesenteroides: Bilan • Production similaire à la souche sauvage • Production inférieure à DSM20484 (pFBYC04) • Elimination de mesI, mesH et mesF •  Production similaire à DSM20484 (pFBYC04) •  Système satisfaisant pour expression de bactériocines

21. Expression hétérologue de peptides • Utilisation du système à deux plasmides • Production de MesB105 • Production de la pédiocine PA-1 • Production d’autres peptides •  Peptide Vaso Intestinal - leader de MesB105 reconnu - protéine d’immunité codée par mesH - co-production de MesY105 et MesB105 • promoteur de MesY105 nécessaire • leader de la pédiocine PA-1 reconnu

22. Mutagenèse aléatoire par PCR: Mise au point d’un protocole • Un codon muté par séquence codant MesY105 mature • Conditions particulières de PCR • - MnCl2/ MgCl2 = 1/5 • - déséquilibre en nucléotides (dGTP limitant) •  12 séquences mutées sur 40 analysées

23. 1 10 20 30  MesY105 Y3C C14S C14Y R28C W37C KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW --C---------------------------------- -------------S----------------------- -------------Y----------------------- ---------------------------C--------- ------------------------------------C Mutagenèse aléatoire par PCR: obtention des peptides dérivés  Sur 12 peptides potentiels, 5 non obtenus - séquences ADN vérifiées - problème de maturation ou sécrétion?

24. 1 10 20 30  G13E H8L H8Y MesY105 H8L H8Y G13E S15F *W18F A21V A24P R28H *W37F *mes36 KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW -------L----------------------------- -------Y----------------------------- ------------E------------------------ --------------F---------------------- -----------------F------------------- --------------------V---------------- -----------------------P------------- ---------------------------H--------- ------------------------------------F KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGF A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 Christian Lacombe, communication personnelle MesY105 et ses dérivés :activité anti-Listeria • Mes Y105 et dix dérivés testés • Activité antagoniste réduite pour tous les dérivés • Trois groupes en fonction de l’activité

25. Dérivés de MesY105 :types de modification • Encombrement stérique (S15F, A21V, R28H) • Charge (H8Y, H8L,G13E) • Polarité (H8L, S15F) • Point de flexibilité de l’hélice (A21V, R28H) • Résidu casseur d’hélice (A24P) • Résidus à l’interface eau/lipides (W18F, W37F, mes36)

26. MesY105 et ses dérivés :structure secondaire • Dichroïsme circulaire en milieu mimant la membrane • Comparaison du degré d’hélicité / MesY105 • Trifluoroéthanol (TFE) •  Favorise structure en hélice • Lysophosphatidylcholine (LPC) •  Lipide zwittérionique formant des micelles

27. G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 MesY105 et ses dérivés :structure secondaire (2) • Peptides non structurés dans l’eau • Structuration progressive avec quantités croissantes de TFE • Hélicité différente dans TFE et LPC • Hélicité variable selon le peptide • Hélicité n’est pas seule à déterminer l’activité MesY105

28. MesY105 et ses dérivés :interaction avec les micelles (1) • Fluorescence intrinsèque des tryptophanes • Longueur d’onde d’émission dépend du solvant • Tryptophanes de MesY105: • - exposés au solvant dans tampon aqueux • - peu enfouis dans les micelles Dl

29. G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 MesY105 et ses dérivés :interactions avec les micelles (2) • Trois dérivés avec substitution de tryptophane: • - W18 plus enfoui que W37 • - aromaticité importante en position 37 • Autres dérivés: • - trois interagissent très peu: activité faible • - interaction similaire à MesY105 •  Lien entre activité et interaction avec la membrane

30. Christian Lacombe, communication personnelle MesY105 et ses dérivés :structure tridimensionnelle • Modélisation sur la base de la leucocine A • - structure similaire à la leucocine A • - seul a24p est modifié • Résonance magnétique nucléaire • - résultats préliminaires • - partie N-terminale en feuillet b • - partie C-terminale à déterminer

31. G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 MesY105 et ses dérivés :Bilan (partie N-terminale) • H8L • H8Y • G13E • S15F • Baisse d’activité liée au changement de charge • Pas ou peu d’impact sur l’hélicité • Interactions électrostatiques • Reconnaissance par récepteur? • Pas d’impact sur hélicité ou interaction avec les micelles • Position moins importante • Interaction au récepteur modulée?

32. G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 MesY105 et ses dérivés :Bilan (hélice a) • A21V • A24P • R28H • Pas de rapport entre activité, hélicité et interaction avec les micelles • Point de flexibilité de l’hélice? • Interaction au récepteur modulée? Lien entre activité, hélicité et interaction avec les micelles  Hélice a nécessaire mais pas suffisante • Lien entre activité, hélicité et interaction avec les micelles • Point de flexibilité de l’hélice? • Positionnement hélice dans membrane?

33. G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 MesY105 et ses dérivés :Bilan (tryptophanes) • W18F • W37F • mes36 • Interface membrane/solvant • W18 plus enfoui que W37 • Aromaticité indispensable en position 37 • Insertion dans la membrane • W37 stabilise position dans la membrane (épingle à cheveux)

34. G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 Conclusion: interaction au récepteur • Récepteur EIItMan (Gravesen et coll., 2002, Dalet et coll., 2001) • Interaction récepteur/ partie N-terminale • - rôle de la région conservée • Partie C-terminale module l’interaction • - rôle de A21 • - spécificité de cible (Fimland et coll., 1996)

35. phase hydrophile + + + W F W R phase hydrophobe Conclusion: interaction avec la membrane • Interactions électrostatiques membrane/ région N-terminale • - rôle des charges • W18 et W37 favorisent l’enfouissement de l’hélice • W18, W37 et R28 stabilisent position de l’hélice • Epingle à cheveux • Hélice: • - non-transmembranaire • - angle faible d’insertion (Bennik et coll., 1998)

36. Bactériocine de classe IIa

37. Bactériocine de classe IIa Interaction initiale avec le PTS EIItMan PTS EIItMan

38. Interaction initiale avec le PTS EIItMan

39. Installation dans la membrane

40. Installation dans la membrane

41. Association de plusieurs molécules

42. fuite de matériel cellulaire dissipation de la force protomotrice Ouverture du PTS EIItMan Destructuration de la membrane

43. Perspectives (1) • Structure tridimensionnelle • Mutagenèse dirigée • - A21, R28 • - point de flexibilité • - plus hydrophobe/ hydrophile • - épingle à cheveux • - résidus clés N-terminaux

44. Perspectives (2) • Dichroïsme sur modèles plus réalistes • Interaction récepteur/ peptide • Comparaison des spectres • Production de peptides à intérêt thérapeutique

46. ATP RR ADP Régulation de l’expression IF HPK HPK-P RR-P Activation des gènes Simon, 2001

47. Antimicrobiens: éléments structuraux • Charge du peptide • Hélicité • Domaines hydrophile et hydrophobe de l’hélice • Composition en lipides • Récepteur?

48. Hélice a

49. phase hydrophile + + W W F phase hydrophobe Hélice a flexible

50. Lysophosphatidylcholine