第三章 病毒和亚病毒

1. 第三章 病毒和亚病毒 第一节 病毒 第二节 噬菌体

2. 本章教学目标： • 1. 了解病毒的一般特性； • 2. 理解噬菌体的增殖过程，温和噬菌体与溶源性； • 3. 掌握病毒对食品发酵工业的危害及应用。

3. 本章重点和难点： • 1. 温和噬菌体与溶源性，噬菌体的增殖过程； • 2. 病毒对食品发酵工业的危害及应用。 • 教学学时： 3学时 • 教学方法： 多媒体教学

4. 第一节 病 毒（Virus） • 定义：是一类比细菌更小，能通过细菌过滤器，仅含一种类型核酸（或DNA或RNA），只能在活细胞内生长繁殖的非细胞形态的微生物。 • 病毒可引起人、动物和植物的传染病，可能还与癌症有关，危害极大。 • 病毒作为噬菌体对发酵工业具有极其重要的危害，同时在生物技术研究领域也有广阔的应用前景。如，利用病毒的专性寄生特性，可进行细菌分类鉴定；利用病毒的遗传特性，进行基因工程研究等。

5. 一、病毒的生物学特性 • 具有以下几个重要基本特征：1．个体极小病毒粒子（Viron）大小用纳米（nm）表示。一般病毒大小100nm左右。最大者如痘病毒（Poxviruses）大小达300～450nm×170～260nm，最长的如丝状病毒科（Filoviridae）病毒粒子大小为80nm×790～14000nm。最小的只有10nm，如口蹄疫病毒（Footand Mouth Disease Virus，FMDV） • 2．无细胞结构由核酸和蛋白质组成的有生命特征的核蛋白颗粒，且只含一种核酸，或RNA，或DNA。 口蹄疫病毒 动物痘病毒

6. 3．专性活体寄生不具备维持其生命活动完整的酶系统，只有在活的宿主细胞内才能表现生命活动，具生命特征，所以病毒是严格的专性活细胞寄生生物。3．专性活体寄生不具备维持其生命活动完整的酶系统，只有在活的宿主细胞内才能表现生命活动，具生命特征，所以病毒是严格的专性活细胞寄生生物。 • 4．抵抗力一般情况下，病毒对自然环境的抵抗力是很小的，对阳光、紫外线、干燥和温度都很敏感。绝大多数病毒不同程度对干扰素敏感，而现有抗生素对病毒无特效。

7. 二、病毒的基本形态和大小 病毒外形多呈球状或似球状，少数病毒呈杆状、丝状、弹状或砖块状，而噬菌体多呈蝌蚪状。病毒大小的单位为纳米（nm）和埃（A）（1nm =10A）, 病毒大小不一，一般为10～250nm之间。病毒大多能通过细菌过滤器。

8. 各种病毒举例1

9. 各种病毒举例2

10. 三、病毒的化学组分和基本结构 • 中心为核酸，含病毒基因组，能为病毒的增殖、遗传、变异等功能提供遗传信息。外周包有蛋白质外壳，称衣壳体（Capsid），由衣壳粒（Capsomere）规则排列组成。衣壳粒由单个或多个多肽分子构成。衣壳粒的排列有的在核酸外面整齐排列呈二十面立体对称型，有的紧绕核酸呈螺旋对称型，也有壳粒排列不规律的复合对称型。

11. 四、几种常见病毒（举例） • 腺病毒，动物病毒，二十面体对称病毒的代表。无包膜，有12个角，20个面，30条棱。每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维，称为刺突（spike）。核心为线状双链DNA构成。 腺病毒肺炎，图 中央可见肿大肺 泡上皮细胞中的 核内包含体。

12. HIV病毒，动物病毒， 全称人类免疫缺陷病毒。 外壳蛋白 类脂层 衣壳

13. 艾滋病初期症状（常识补充） • 症状常在感染后2-4周内出现。平均在3个月后才能由验血证实感染。 • 1.持续低热(93%)2.疲乏(90%)3.原因不明的喉炎(70%)4.体重突然下降10%以上(70%)5.头痛(60%)6.恶心(60%)7.肌肉和关节痛(60%)8.夜间盗汗(50%)9.持续腹泻(50%)10.皮疹(40%) 据国际研究和临床经验，艾滋病发病前1～4年内，大多艾滋病患者都会单独出现口腔症状，表现为各种典型口腔病损。这是发现和诊断艾滋病病毒感染者主要指征。

14. 卡波济氏肉瘤 发生在皮肤、粘膜、淋巴结、内脏的恶性肿瘤。粉红、红色或紫色的斑疹或斑片，逐渐发展为斑块或结节，如表面有溃疡、出血或感染，疼痛性肿块则明显可见。 艾滋病中期播散 性颈部淋巴结核

15. 烟草花叶病毒 • 植物病毒，螺旋对称病毒的代表。外形直杆形，由95%的衣壳和5%的单链DNA组成。 正常的烟草叶与被烟草花 叶病毒侵染的叶（左）

16. 大肠杆菌噬菌体T4 • 微生物病毒，T4由头部、颈部和尾部3部分构成，头部呈二十面体对称而尾部呈螺旋对称，是一种复合对称结构。 颈部： 颈环和颈须 刺突

17. 病毒的增殖 • 可分为五个连续的阶段：即吸附、侵入、复制合成、装配成熟和释放。 （一）吸附病毒感染细胞先要吸附在易感染细胞上。这一过程又分两步。第一步是随机碰撞。第二步为特异性结合。 （二）侵入 病毒吸附在宿主胞膜后可通过多种方式进入细胞内。 有的病毒是通过细胞膜吞入，称为病毒胞饮。 有的病毒在进入寄主细胞时仅将核酸侵入，衣壳留在细胞表面。

18. （三）复制合成 • 病毒的生物合成： • 1．按亲代病毒的样板转录mRNA；2．由mRNA 转录“早期蛋白”。这些早期蛋白一般为非结构蛋白，如合成核酸时所需要的RNA或DNA多聚酶，控制宿主蛋白质和核酸合成的调控蛋白等；3．复制核酸，以亲代病毒核酸为模板；4．合成“晚期蛋白”，主要由子代核酸转录mRNA，再转译为“晚期蛋白”。晚期蛋白主要为子代病毒的衣壳蛋白以及在病毒形成阶段起作用的非结构蛋白等。

19. 不同类型的病毒合成mRNA的六条途径 ⑥+RNA （逆转录病毒） ①±DNA （T4，天花病毒） ①+DNA （Φ×174） -DNA ±DNA ±DNA ③ ±RNA （呼肠孤病毒） + mRNA -RNA ④ -RNA （麻疹病毒、 新城疫病毒） ⑤+RNA （RNA噬菌体 脊髓灰质炎病毒）

20. （四）装配成熟 • 病毒核酸与蛋白质合成完毕后，根据病毒种类不同，或在细胞核内或细胞浆内进行装配，形成核衣壳。有囊膜的病毒形成核衣壳之后，其囊膜是通过细胞核膜或细胞膜时获得，并以“出芽”的方式释放。无囊膜的病毒在宿主细胞装配成核衣壳后，即为成熟的病毒粒子。 • （五）释放 • 或以细胞破裂的方式，或以反吞饮的方式释放出来。还有的病毒能在宿主细胞间以转移的方式感染，在细胞间质中很少发现病毒粒子。

21. 1 2 3 4 5 6 第二节 噬菌体 （一）噬菌体的概念及其主要类型专门侵害细菌和放线菌等微生物的病毒称为噬菌体（phage）。从形态学角度又可将其分为更为详细的六群： 1、2、3群都有尾部，1群具有收缩性的尾鞘，2群有长的非收缩性的尾部，3群的尾部很短。 4、5两群没有尾部，两者的区别是4群外壳顶端蛋白质衣壳粒较大，5群则较小。 6群为纤线形的噬菌体。

22. （二）噬菌体的结构特点 • 构造：头部呈现六角晶柱形，经染色处理和高度放大，可观察到头部呈20面体的结构，由蛋白质组成外壳，内含核酸。 • 尾部由一中空的管状体尾髓和可收缩的蛋白质尾鞘所组成。与头部相接处呈现收隘部分，称为颈部。尾端具有六边形的基片，其上生出六个刺突，并缠绕着六根细长的尾丝。

23. 1 2 3 4 5 6 （三）噬菌体的化学成分 • 绝大部分是核酸和蛋白质，占病毒粒子重量的90%以上，其中核酸占40%～50%。 • 噬菌体按核酸类型分DNA和RNA噬菌体。一般多为DNA噬菌体，有不少噬菌体所含核酸是RNA。 • 噬菌体中核酸链有单链的也有双链的。 • 1、2、3三群由双链DNA组成； • 4、6群为DNA单链； • 5群为RNA单链。 • 某些噬菌体的核酸中含有异常碱基，如大肠杆菌T系偶数噬菌体，无胞嘧啶而代之以5-羟甲胞嘧啶。某些枯草菌噬菌体的DNA中无胸腺嘧啶而代之以尿嘧啶或羟甲基尿嘧啶。

24. 大肠杆菌噬菌体的形态及其核酸特性

25. （四）烈性噬菌体和温和性噬菌体 • 噬菌体感染细菌后可产生两种后果： • 噬菌体增殖而引起细菌裂解； • 噬菌体不增殖而使细菌建立带噬菌体基因的溶原状态（Lysogenic State）。 • 1．烈性噬菌体（Virulent phage） • 凡能在敏感细菌中增殖使之裂解的噬菌体，称之为烈性噬菌体。通常是把烈性噬菌体的繁殖看成噬菌体的正常表现。这种噬菌体在敏感细菌内的复制过程与一般病毒相似，例如T4。

27. 2．温和性噬菌体（Temperate phage） • 细菌分裂时，噬菌体基因随机分布到两个子代细菌的基因中去，称为温和性噬菌体或溶原性噬菌体（ Lysogenic phage）。带噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌（Lysogenic bacterium），整合在细胞核上的噬菌体核酸称为原噬菌体（Prophage）。 • 噬菌体的溶原状态有时能自发地终止，结果导致噬菌体增殖引起细菌裂解。 • 用紫外线照射、电离辐射、氮芥子气、乙酰亚胺等处理溶原性细菌，能显著提高原噬菌体转变为噬菌体增殖和细菌细胞裂解的发生频率。

28. ——定量描述烈性噬菌体增殖规律的实验曲线：潜伏期、裂解期、平稳期——定量描述烈性噬菌体增殖规律的实验曲线：潜伏期、裂解期、平稳期 A：一群噬菌体作用于一群细菌细胞的结果。 B：单个噬菌体在单个细胞内的增殖情况。

29. （五）噬菌体的效价及测定 • 1. 平板法测定每毫升试样中所含具有侵染性噬菌体粒子数，又称为噬菌斑形成单位（pfu），即噬菌体的效价。 • 2. 噬菌体是效价测定（1）稀释噬菌体（a）将4 管含有0.9 毫升液体培养基的试管分别标写10-3，10-4，10-5和10-6。(b)用1 毫升无菌吸管吸0.1 毫升10-2大肠杆菌噬菌体，注入10-3的试管中，旋摇试管，使混匀。(c)用另一支无菌吸管从吸0.1 毫升10-3 大肠杆菌噬菌体，注入10-4的试管中，旋摇试管，使混匀。余类推，稀释到10-6管中，混匀，如图所示。

31. （2）噬菌体与菌液的混合（a）将 5 支灭菌空试管分别标写10-4，10-5，10-6，10-7和对照( b ）用吸管从 10 -3噬菌体稀释管吸0.1 毫升加人 10-4的空试管内，用另一支吸管从 10-4 稀释管内吸0.1 毫升 时加人10-5空试管内，如图 1 直至 10-7 管。( C）将大肠杆菌培养液摇匀，用吸管取菌液 0.9 毫升加人对照试管内，再吸0.9 毫升加入10-7试管，如此从最后一管加起，直至 10-4管，各管均加 0.9 毫升大肠杆菌培养液。（D）将以上试管旋摇混匀。

32. （1）将5 管上层培养基融化，标10-4，10-5，10-6，10-7 和对照，冷却至48℃，并放入48℃水浴箱内。（2 ）分别将 4 管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合液后，立即摇匀。（3）混合液加入上层培养基中（4）接种了的上层培养基倒入底层平板上 。（a ）将摇匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板。 （b ）凝固后，放置37℃培养。 • (5) 观察平板中的噬菌斑将每个稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取30～300 个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。 • 噬菌体效价=噬菌斑数 x 稀释倍数 x 10

33. （六）噬菌体的监测方法 • 对噬菌体监测只能用间接方法进行。这些方法主要是根据噬菌体的生物学特性而设计的。 • 第一，噬菌体对寄主具有高度特异性，可利用敏感菌株对其进行培养； • 第二，噬菌体侵染宿主细胞后可引起裂解，通过观察在含敏感菌株的琼脂平板上接种噬菌体培养后是否出现噬菌斑，或观察在含敏感菌的液体培养基中培养物是否变清来进行判断。 • 常用的方法有载片快速检测法、单层琼脂法和双层琼脂法。

34. 小结 病毒的群体特征 病毒包含体 • 病毒大量聚集并使寄主细胞发生病变时，形成具有一定形态、构造并能在光镜下加以识别的特殊群体，在动植物细胞中可形成病毒包含体； • 在植物叶片上可形成枯斑； • 在微生物细胞中可形成噬菌斑。

35. 第三节 亚病毒 • 只含蛋白质或一种核酸成分的病毒，称为亚病毒。 • 只含RNA的具有感染性的分子病原体，叫类病毒（viroids） 。 • 与之相反，朊病毒（prions）是一种只含蛋白，缺少核酸具感染性的特异因子。 • 拟病毒，又称类类病毒或卫星病毒。指一类包裹在真病毒粒子的有缺陷的类病毒。只含RNA或DNA。被拟病毒寄生的真病毒叫辅助病毒。

36. 类病毒是寄生于高等生物细胞中一类最小的新病原体，属亚病毒或不完全病毒。类病毒是寄生于高等生物细胞中一类最小的新病原体，属亚病毒或不完全病毒。 • 结构：仅一个无蛋白质外壳的游离的环状单链RNA分子（暂未发现DNA的类病毒），分子量近10万道尔顿（病毒分子量200万～2亿道尔顿，其中核酸仅占病毒全质量的1～5%）。 • 自然条件下，类病毒形状是特殊棍棒状的二级结构。类病毒是具有高度侵染性的病原体，与病毒一样能侵染动植物，在感染的植物组织中，类病毒不出现有病毒样的颗粒，但这种小分子RNA能在敏感细胞中自我复制，并不需要辅助病毒。 • 自然条件下，类病毒是严格的纯寄生，引起植物发病、死亡。据报道，类病毒可侵染人（引起风湿病），侵染植物，引起多种病害，如海南椰子死亡病，黄瓜苍白病，菊花矮缩病、绿皮病，柑桔裂皮病等。

37. 拟病毒，是一种类似于类病毒的病毒，其核酸组成，大小，二级结构（分子内部的碱基配对形成的二级结构）均与类病毒相似，故又称之为类似类病毒。(Viroid—Like RNA)，又称为拟病毒，碱基对350个左右 ，但依靠辅助病毒才能复制。 •     已知下列病毒含有拟病毒：绒毛烟斑驳病毒的VLMoV ：地三叶草斑驳病毒等。

38. 朊病毒，只含蛋白质外壳的病毒。 • 可使人及动物致病，如（山）绵羊疯痒病，这种类病毒可侵入山羊胎胞中使胎羊致死。 • ⊙医源性“海绵类脑血管病变”或“朊病毒感染病” ，是世界性顽疾之一。病征：四肢僵值，语无论次，尿便失禁。CHN 1999年发现首例此病。 • ⊙人Kuru病（库鲁病）：中枢神经系统缓慢进行性病症。 • ⊙1997年的疯牛病（有学者认为是朊病毒感染引起）。 • ⊙阿尔茨海默氏病，早老性痴呆。 •  朊病毒是众多假说之一，它的本质并未完全明确，ICIV（国际病毒委员会）1987年曾把它删除，作为未分类的病原因子。 • 美国普鲁西内尔获1997年获诺贝尔奖（发现朊病毒病)。

39. 第四节 病毒的危害与作用 • 1.人类及动物的疾病 • 2.植物产量 • 3.发酵工业的危害 • 4.目前研究应用

40. 噬菌体与发酵工业的关系 1．抗生素发酵与噬菌体的污染 1947年使用灰色链霉菌（Streptomyces griseus）发酵生产链霉素时，曾发生由于噬菌体感染而出现溶菌现象，菌体减少，培养液变黑，抗生素效价不上升。1951年以来，曾有一些关于金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）的噬菌体的报导，我国一些四环素发酵工厂也发现由噬菌体引起的异常发酵现象。所以在微生物发酵工业生产上，因噬菌体感染造成的损失是不小的，必须采取一定的预防措施。

41. 2．食品工业的噬菌体污染 食品工业上采用乳酸菌、醋酸菌、棒状杆菌等进行发酵，生产各种不同的食品。如果生产过程中受到相应的噬菌体感染时，发酵作用就会减慢，甚至停止，不积累发酵产物，菌体很快消失，整个发酵生产就被破坏。 3．细菌的鉴定和分型 由于噬菌体的作用具有高度特异性，即一种噬菌体只能裂解和它相应的细菌，因此可用于细菌的鉴定。而且噬菌体的这种作用除具有种的特异性外，还具有型的特异性。一种噬菌体只能作用于该种细菌的某一型。于是可利用某一特定的噬菌体，对细菌进行分型鉴定。目前已经利用噬菌体将金黄色葡萄球菌分为72型。

42. 4．诊断和治疗疾病 噬菌体感染相应的细菌后，在适宜培养条件下，能迅速繁殖，产生大量噬菌体的子代。利用这一特性可将已知噬菌体加入被检材料中共同孵育，如果出现噬菌体效价增长，就证实材料中有相应的细菌存在。在疾病治疗中也可以使用噬菌体来裂解细菌，特别是在治疗某些创伤感染时，由于多数细菌对多种抗生素都产生了耐药性，在药物治疗效果不佳的情况下，最有效的办法就是采用相应噬菌体来治疗。现利用葡萄菌、链球菌、尤其是绿脓杆菌的噬菌体用于治疗已取得了良好的效果。

43. 5．分子生物学研究的实验工具 由于噬菌体的基因数目少，噬菌体变异或遗传性缺陷株又容易辨认、选择和进行遗传性分析，因此，可以通过物理的或化学的方法诱变使其产生多种噬菌体的蚀斑型突变株和条件致死突变株，然后利用这些突变株的基因重新组合试验，来研究噬菌体基因的排列顺序和功能。

44. 诺如病毒 • 9、10月是贝类上市旺季，也是诺如病毒感染性腹泻的高发季节，谨防诺如病毒引发腹疼、腹泻、呕吐等。 • 诺如病毒感染发病急、传播快、范围广，一般患者3天可自愈，体弱老人和儿童易继发如肺部感染，水、电解质平衡紊乱等疾病。但诺如病毒感染性腹泻可防治。 • 诺如病毒1968年被发现，属杯状病毒科，呈球形，直径30nm。表面覆盖着带杯状凹坑的结构蛋白，遗传物质为单链RNA。诺罗病毒生存和变异能力很强，目前按其遗传基因分类已发现至少10种变异病毒。

45. 思考题： • 什么叫病毒、类病毒、噬菌体？ • 病毒的一般特性是什么？ • 名词解释：病毒粒子  壳体  壳粒  核壳  包膜 • 病毒的成分及其结构是什么？病毒核酸有哪些类型？ • 病毒有哪几种对称方式？ • 病毒分成哪几大类？  • 什么是病毒包含体？它有什么实践意义？ • 什么是病毒的一步生长曲线？对生产和科研有何指导意义？ • 什么叫毒性噬菌体？简述其增殖裂解细胞的过程。 • 什么是温和噬菌体？温和噬菌体与溶源性细胞的关系如何？ • 名词解释：溶源细胞  溶源性  前噬菌体  溶源细胞的复愈 • 在发酵工业中，为何常常遭噬菌体危害？如何防治？

46. 下一章预习提要： • 微生物的营养类型； • 微生物培养基的分类以及常用培养基； • 微生物的培养。

47. 完 谢谢