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프로바이오틱 유산균의 기능성 박명수 1 , 권 빈 1.2 , 조상희 1 , 염은미 2 , 김남주 2 , 김혜영 2 , 지근억 1.2 , 1) ㈜ 비피도 연구소

프로바이오틱 유산균의 기능성 박명수 1 , 권 빈 1.2 , 조상희 1 , 염은미 2 , 김남주 2 , 김혜영 2 , 지근억 1.2 , 1) ㈜ 비피도 연구소 2) 서울대 식품영양학과 지 근 억. 배 경. Human large colon : Bacterial fermentor * Cell density = 10 11 - 10 12 CFU/ml * Volume = 6 Cm diameter x 1.5 m * Total bacterial number = 10 14 cfu/ colon

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프로바이오틱 유산균의 기능성 박명수 1 , 권 빈 1.2 , 조상희 1 , 염은미 2 , 김남주 2 , 김혜영 2 , 지근억 1.2 , 1) ㈜ 비피도 연구소

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Presentation Transcript

  1. 프로바이오틱 유산균의 기능성 박명수1, 권 빈1.2, 조상희1, 염은미2, 김남주2, 김혜영2, 지근억1.2, 1) ㈜비피도 연구소 2)서울대 식품영양학과 지 근 억

  2. 배 경 Human large colon : Bacterial fermentor * Cell density = 10 11- 1012 CFU/ml * Volume = 6 Cm diameter x 1.5 m * Total bacterial number = 1014 cfu/ colon * Major products = short chain fatty acids, ammonia, methane, H2, amine, etc. * Host : control of medium * Who is harmful ? * Who is beneficial ? 장내 세균의 중량 : 1.0-1.5kg 장내 세균의 80%는 현재 배양 불가 • Dr. Benno, Yoshimi Asian Conference on Lactic Acid Bacteria (2001)

  3. 배경 장내세균과 인체와의 관계 장 내 세 균 인 체 • 세균의 대사산물 (저급 지방산)흡수하여 에너지 획득 (섭취열량의 10-15%) • 식품섭취의 부족시 : 득 • 식품섭취의 과잉시 : 실 • 단백질, 지방 등은 대부분 세균에 의하여 분해되어 독성물질로 변환 • 장내세균은 장관벽을 두텁게 하고 면역기관을 발달 시킴 • 혐기성 미생물의 서식장소 • 영양성분의 섭취 • 적정수준의 독성(예, Bacteroides) • 을 발휘하여 인체를 공격 • 독성이 강하여 인체에 큰 해를 입히는 균들은 도태

  4. 50일된 유아의 변 63세 노인의 변 33세 여성의 변 배경 인체의 대장 = 미생물 발효조

  5. 인체에 대한 장내 미생물의 영향 유해균/독성균 유익균 11 Bacteroides 독성균에 대한 억제 작용 Bifidobacterium 장 부패 촉진 Eubacterium 8 발암물질 생성 소화 촉진 Streptococcus 장 부패 억제 E. coli Lactobacillus 6 감염증과 설사 유발 C. perfringens Staphylococcus Proteus 2 Log CFU/g feces

  6. 배경 Bacteroides, Eubacterium 11 10 Bifidobacterium 8 E. coli, Streptococcus Log counts / g feces 6 Lactobacillus 4 C. perfringens Birth Infants Maturity Aged 연령에 따른 장내 균총의 변화 (Mitsuoka)

  7. 인체에 유익한 비피더스균의 작용 설사 억제 변비 개선 혈중 콜레스테롤 저하 유해균 억제 장내 균총 유당 불내증 개선 비타민 합성 B2,B6,B12 비피더스균 면역 체계 항 종양 효과 소화작용 도움

  8. I : 비피더스, 유산균 벡터 및 유용 유전자 발현 * 비피더스 Secretion 벡터 * 대장균 Secretion 벡터 *Leuconostoc 벡터

  9. CORE TECHNOLOGY MCS GRAS promoter GRAS rep gene GRAS selection marker Bifidobacterium GRAS-host GRAS-vector GRAS : Generally Recognized As Safe BIFIDO

  10. Advantages of Bifidus system E.coli system Bifidus system DA 1. Cellular toxicity (LPS) 2. Weak acid tolerance 3. Inevitable Purification process 4. Weak secretion 5. Environmental contamination 6. Inapplicable to Food AD 1. GRAS 2. Applicable to Food and Pharmaceuticals 3. Purification is an optional step 4. Environment-friendly product 5. Strong secretion system 6. Weak external protease activity 7. Possible to secure platform technology • DA • Short research • history • 2. Poorly defined • metabolic pathway • 3. Absence of good • expression system • 4. Weak molecular • breeding technique AD 1. Long research history 2. Well defined metabolic pathway 3. Full genome-sequenced 4. Easy to manipulate 5. Mass culture and Mass production BIFIDO

  11. 비피더스 발현 시스템의 활용 예 형질전환 되지 않은 비피더스 형질전환 된 비피더스 BIFIDO

  12. Methods & Results /ml culture Medium : Modified MRS except for phosphate reagent Cell extract : 9.5X concentration , Sonication Supernatant : Centrifugation Phytase Liquid Assay : Heinonen-Lahti Method 94% 6% Figure 1. Phytase assay measuring phosphate released by phytase

  13. 유산균 유전체 염기서열 결정

  14. 유산균 유전자 재조합체 • 유산균을 이용한 건강 기능성 및 치료용 • 유전의 발현 • 저칼로리 감미 소재 생산 균주 개발 • - 알라닌, 소비톨, 만니톨, 타가토스 생산 균주 • 비타민 생산 균주 개발 - 엽산, 리보플라빈, • 비타민 B12 • 치료용 유산균 - 염증 치료제인 인터루킨 생산 • 균주, 병원성 균주에 대한 항원 발현 • 백신용 균주 등

  15. 차별적 핵심 연구, 산업화, 공동 연구 • 유산균 유전자 벡터 및 발현 기술 의 원천 기술 확보 • Bifidobacterium - E. coli shuttle vector • Leuconostoc - E. coli shuttle vector • E. coli secretion vector • 발현 유전자 : cholesterol oxidase, phytase, endostatin, amylase • 균체밖으로 90 % 이상 분비

  16. II : 유용 생리활성 유산균 제품 개발

  17. 대장암 증가추이 1970년대 7위 1990년대 4위 2000년대 2위 출처 : (한국인 발생 대장암, 서울 삼성병원 연구과제)

  18. Acid Bile Oxygen Bacteriocin Antimutagenicity Immune modulation Intestinal colonization Probiotic Bifidobacterium Screening Healthy human subjects Selective screening Random screening Growth rate Sensory evaluation Product development & Evaluation

  19. 배 경 • 로타바이러스: Reoviridae과에 속하며 어린이 및 유아의 급성소아장염유발 원인 바이러스로 1943년 Light와 Hodes에 의해 보고됨. • 서울 지역의 소아 설사군을 대상으로 설사 유발 원인을 조사한 결과 rotavirus가 설사군의 47%에서 검출되어 가장 높은 출현빈도를 나타내고 있으며 이는 세계보건기구의 통계치인 20%의 두배를 웃도는 수치임. • 작년 2001년도에 발생한 경기도 고양시 산후조리원의 영아 집단 사망의 원인은 로타바이러스로 밝혀져 대책이 시급함. • 1999년 미국에서 와이어스社(Wyeth)에 의해 로타바이러스 백신이 개발돼 식품의약청(FDA)의승인을 받은 적이 있지만 백신 투여 후 ‘장중첩 증상’ 등의 부작용이 있어 바로 허가가 취소돼 현재까지 세계적으로 부작용 없는 로타바이러스 백신은 없는 것으로 알려짐. • 최근 장내 유용 미생물을 이용한 로타바이러스의 억제에 관한 연구가 진행되고 있음:probiotics의 경구투여시 로타바이러스성 설사의 강도와 기간을 줄여줌 •  현재까지는 백신등의 의약품 차원에서 연구가 되었으나 본 연구에서는 장에 천연적으로 존재하는 비피더스를 이용하여 안전하게 제어하고자 함

  20. IC50=0.05ug/ml Screening for anitrotaviral bifidus 활성 단백질 분리 정제 Internal sequencing PCR-cloning

  21. CLA정의 • Conjugated Linoleic Acid (CLA): Linoleic Acid 의 • 이성질체 (cis-9, trans-11) • Linoleic Acid 를 화학 합성하여 생산 • (cis-9, trans-11; trans-10, cis-12) • Rumen Bacteria에서 의해 합성(cis-9, trans-11) • Linoleic Acid Isomerase 에서 의해 생화학적으로 • 합성(cis-9, trans-11)

  22. CLA기능 • 항암 효과: Mouse 피부암, 전위암, 복수암 억제효과 • 항동맥 경화 효과: Hamster의 대동맥 경화증 발생억제 • 콜레스테롤 축적 저하 효과: 돼지 및 닭의 콜레스테롤 함량 저하 • 체지방 감소 효과: 인체의 체중 감소 • 항균 효과: 곰팡이 Aspergillus와 Rhizopus생육저해, 식중독균Listeria와 Vibrio균 생육저해 • 항산화 효과: CLA 함유 돼지고기 및 닭고기에서 Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)의 생성 저하 및 저장성 증가

  23. Continuous production of CLA from LA by immobilized L. reuteri in a packed-bed bioreactor 50 mM Tris-HCl buffer as pH 7.5 and 0.05% LA at 25oC. CLA production in a packed-bed bioreactor () and replacement reaction in a test tube containing whole cell of L. reuteri ().

  24. Continuous production of CLA from LA by immobilized enzyme in a packed-bed bioreactor 50 mM Tris-HCl buffer as pH 7.5 and 0.05% LA at 25oC. CLA production in a packed-bed bioreactor of immobilized enzyme() and replacement reaction in a test tube containing free enzyme ().

  25. GABA의 작용 • 억제성 신경전달물질로서 혈압강하, 진정작용 등의 작용을 하고, 외에도 뇌혈류를 증가시켜 산소공급량을 많게 하고 뇌세포 대사기능을 활발하게 하여 자율신경 실조증, 중풍과 치매예방, 기억력증진, 불면증 등에도 효과를 인정받고 있음. • 그밖에 간기능 활성과 알콜대사 촉진 기능으로 숙취제거 음료에도 이용. 비만해소작용과 신장기능 촉진작용도 보고되고 있음.

  26. GABA • 생물계에서 Gluramate에서 이산화탄소가 빠져나가는 과정을 거쳐 효소로서 생성. • 식물계에서는 Glutamate decarboxlyase와 함께 GABA가 널리 존재하고 있음이 오래전부터 알려져 있었으나 동물에서는 뇌 속에 존재한다는 것이 1950년에 처음 발견되었고, 특히 포유동물의 뇌 속에만 존재하는 특이한 아미노산으로 이에 대한 다양한 작용들이 보고되고있음. • 대다수의 유산균에서도 GABA가 생성되고 있는 것으로 보이고, lactococcus lactis, lactobacillius brevis등이 대표적. 특히 lactobacillius brevis경우 8개 중4개의 strain이 GABA를 생산한다고 보고됨.

  27. Lactobacillus reuteri에 의하여 생산되는 루테린의 항균성

  28. 연속 공정에 의한 루테린 생산

  29. 신제품 개발 사용균주 • Mean numbers of adhering bifidobacteria per 50 Caco-2 cell

  30. 대장암 억제활성 – 균주의 선발 30종의 bifidobacteria균주를 대상으로 배양액 및 균체의 활성을 측정한 결과, 가장 뛰어난 대장암 증식저해활성을 가진bifidobacteriaBGN4를 획득 Bifidobacterium sp. BGN4 Electron scanning morphology of BGN4 • 30개의 bifidobacteria strain 중 가장 활성이 높은 • strain으로서 BGN4를 선발

  31. BGN4의 항암활성 • BGN4의 whole cells 및 cell extract ; HT-29 colon • cancer cell에 대한 증식억제 효과 보임 • Cell line specificity ; 활성의 세포 간 특이성을 보임

  32. 항종양효과-동물실험 The effect of Bifidobacterium spp RD65 and BGN4 on number and size of aberrant crypt foci 1) All the numbers are expressed as Mean ± SE 2) Soy milk powder 3) Bifidobacterium spp

  33. 프로바이오틱스를 이용한 알레르기 예방 • 장 면역은 인체 면역중 50% 이상 차지 • 장관 항원의 샘플링 : Peyer’s patch • Lamina propria : IgA 생산 및 분비, 소장은 주로 IgA1 대장은 주로 IgA2 • 상피 세포 (intestinal epithelial cells) • IEL (intra epithelial T-lymphocyte) • 장내 세균이 없는 동물은 알레르기 발생이 증가 • 프로바이오틱 유산균은 Th1 세포를 활성화, IL-10, TGF-beta, INF-gamma 생산 촉진 • 장관 세포 침투계 정상화, 세균총 정상화, 장관 면역계 조절, 알레르기 발생 면역 억제

  34. 4) 장내 세균과 앨러지 • 앨러지 보유 유아 : Bifidobacteria 감소, clostridia 증가 • Bjorksten et. al. (2001) 앨러지 보유아에서의 bifidobacteria, enterococci 감소 보고 • B. bifidum은 정상아에서, B. adolescentis는 앨러지 보유아에 우세 • B. bifidum은 TNF-alpha 생산 감소 시킴. IL-10 증가 시킴 • B. adolescentis는 반대 • 정상아의 B. bifidum은 장세포 부착능 이 좋음.

  35. 5) Probiotic의 종류별 효과 • Kalliomaki et al. (Lancet 2001) • Lactobacillus sp. GG에 의하여 eczema 감소, 피부 감작은 변화 약함. • Bifidobacteria 는 피부 감작 줄임 : 현재

  36. 선행연구결과 Simultaneous administration of live Bifidobacteria during peanut-sensitization can reduce the peanut specific serum IgE antibody levels in murine(C3H/HeJ) model of food allergy. G1 : Pretreatment of Bifidus, 14-days-before peanut sensitization; G2 : Pre and simultaneous treatment of Bifidus(total 28days) and peanut sensitization; G3 : Sham-treated peanut sensitization ; G4 : Naïve.

  37. 선행연구결과 Effect of Bifidobacterium. Sp BGN-4 on production of IFN-r in splenocytes of sensitized C3H/HeJ.

  38. 제품의 인체평가

  39. 균주의 산업화

  40. Viable cell counts of Lactobacillus acidophillus in commercial probiotic products 출처 : Fundamental Food Microbiology, Academic press, 2001, p220

  41. III : 유산균을 이용한 생물전환

  42. 비피더스에 의한 대두 이소플라본의 생물전환

  43. 활성화 이소플라본 제품

  44. ㈜ 비피도 연구원 서울대 식품미생물실 연구원

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