第 6 章真核生物的基因作图

第6章真核生物的基因作图 Gene Mapping In Eukaryotes Genetics

6.1 基因连锁的发现 • 一．相引与相斥 • 二．连锁法则的建立

6.1.1 相引与相斥 • 杂交的结果F1代都是紫色花，长形花粉，证明紫花对红花是显性，长形花粉对圆形花粉是显性的。在F2代中，开紫花的305株，开红花的76株，带有长形花粉的是305株，圆形花粉的为76株。 • 1905年Bateson和Punnet研究香豌豆两对性状的遗传。他们选择的性状，一对是花的颜色，有紫色和红色两种，紫花(P)对红花(p)是显性；另一对性状是花粉的形状，有长形(L)和圆形(l)两种，长形对圆形是显性。

6.1.1 相引与相斥 结果： • F1两对相对性状均表现为显性，F2出现四种表现型； • F2四种表现型个体数的比例不符合孟德尔的两对因子遗传的分离比9:3:3:1，并且两亲本性状组合类型(紫长和红圆)的实际数高于理论数，而两种新性状组合类型(紫圆和红长)的实际数少于理论数。

6.1.1 相引与相斥 • Punnet又扩大样本重做实验，其结果和前次的相近，仍不符合孟德尔定律，亲组合比理论数多，重组合比理论比少得多。 • 对于这一有趣的现象， Punnet提出了新的假设，认为似乎两对基因在杂交子代中的组合并不是随机的，而是原来属于同一亲本的两个基因(P和L，p和l)更倾向于出现同一配子中，叫做相引(coupling)，原来属于不同亲本的两个基因(P和l，p和 L)之间在形成配子时相互排斥，称为相斥(repulsion)。

6.1.1 相引与相斥 • 为了证明这个假设是否正确，他们又将紫花圆形花粉和红花长形花粉的亲本杂交，结果F1代和第一次杂交相同都是紫花长形花粉，F2得到四种表型，结果也不符合孟德尔的9:3:3:1分离比。 • 虽差异不象前次那样显著，但仍是亲组合比理论数少。也就是说F2代性状的分离比(1) 受到亲本性状的影响；(2) 生殖细胞形成时亲组合的基因相引，重组合的基因相斥。

6.1.1 相引与相斥 • 这个解释对于以上的实验能够自圆其说，但不能解释为什么孟德尔研究的两对性状都是自由组合的。 • 其实相斥和相引的理论，没有和遗传的染色体学说相联系，因此也朦胧地道出了连锁的现象，可惜的是尚未真正地揭示基因在染色体上连锁的规律。 • 在科学发现史上类似的情况曾重复过多次，说明一个好的实验是重要的，但对实验的科学分析、合理的推理更为重要，否则一个重要的发现就会和实验者擦肩而过。 • 摩尔根正是对相似的实验根据遗传的染色体学说进行科学的分析，发现染色体连锁这一重大理论，使得遗传学又向前发展了一步。

6.1.2 连锁法则的建立 • 1910年摩尔根和他的学生Bridges研究了两对基因的遗传，发现了连锁和互换，建立了遗传学第三个基本定律，连锁法则。 • 摩尔根发现果蝇的红眼和紫眼(purple)、长翅和残翅(vestigial)两对性状都是非伴性性状，各自的遗传都符合孟德尔法则。 • 他们将红眼长翅的果蝇和紫眼残翅的果蝇进行杂交，F1代为红眼长翅，然后将F1和双隐性亲本进行测交，所得到的测交后代按孟德尔法则应有四种表型，分离比为1:1:1:1，但实际得到的结果确有相引和相斥的现象，亲组合多于理论数，重组合少于理论数。

6.1.2 连锁法则的建立 • 同贝特森等一样，为了进一步验证，他们又改变组合重新实验，结果相似，仍是亲组合多于理论数，重组合少于理论数。

6.1.2 连锁法则的建立 • 但他们的解释却不相同，摩尔根等认为第一种组合Pr+ 、Vg+两个基因位于同一条染色体上，Pr、Vg也位于另一亲本的相应染色体上，两个亲本都是纯合体，杂交后F1代的这一对染色体分别携带着红眼长翅和紫眼残翅基因。

6.1.2 连锁法则的建立 • 减数分裂时有的细胞在Pr+、Vg+两个基因之间发生染色体的交换重组，产生了重组型配子Pr+Vg和PrVg+，这种配子的比例比亲组合型的配子少， • 所以通过测交所得到的后代不是1:1:1:1，而是亲组合的表型红眼长翅和紫眼残翅为多；重组合的后代红眼残翅、紫眼长翅为少，另一组合的杂交也是同样的道理。

6.1.2 连锁法则的建立 • 他们的假设归纳起来主要有三个论点： • (1) 相引是两个基因位于同一条染色体上，相斥则反之。其实按现代的概念，相引就是顺式（Cis），相斥就是反式（Trans）。 • (2) 同源染色体在减数分裂时发生交换（cross－over）重组（1910年）； • (3) 1911年摩尔根又补充了一点：位置相近的因子相互连锁。连锁和交换的重组称为染色体内重组（intrachromosomal recombination），因染色体自由组合而产生的重组称为染色体间重组（interchromosomal recombination）。

6.2 基因重组和染色体交换的作用 Gene Recombination and the Role of chromosomal Exchange • Morgan’s results were only circumstantial evidence. Proof that physical exchange between chromosomes results in genetic recombination came in the 1930s. • 摩尔根的学说是根据实验的结果，假设在减数分裂时由于染色体的交换导致了遗传重组，虽然这一学说已被广泛接受，但毕竟是个假说，还必须进一步地通过实验加以证实。这里列举两个著名的实验。

6.2.1 玉米实验 • 1931年美国著名的遗传学家麦克林托克指导了她的女博士生克莱顿以玉米为材料进行了一项有趣的实验，为染色体交换导致遗传重组提供了第一个有力的证据。 Barbara McClintock (left) and Harriet Creighton (right) provided evidence that genes are located on chromosomes.

6.2.1 玉米实验 • 他们通过杂交后比较亲本型后代和遗传重组后代的染色体，发现亲本型的后代都保持了亲本的染色体排列，而有的重组型后代的染色体也发生了重组。这样他们把遗传学和染色体内重组的细胞学证据联系起来。 • 玉米的第9号染色体上带有色素基因C和糯质基因Wx，在其短臂上(靠近C)带有一个明显的纽结(Knob)。在长臂端(靠近Wx)有一条来自第8号染色体的附加片段，正常的染色体是没有纽结和易位片段的，因此纽结和附加片段就成为一种细胞学标记。 • 她们选用了一个杂合品系，其中一条染色体带有有色(C)和非糯(wx)基因，两端有标记，而另一条染色体是正常的，两端不带有标记，这条染色体上带有的是无色基因(c)和糯质基因(Wx)。

6.2.2 果蝇实验 一个是Car（Carnation）基因，是隐性突变，纯合体为粉红眼；另一条X染色体的相应等位基因都是野生型的，但染色体带有Y染色体的易位片段。另一个是B（Bar-eye）基因，表型为棒状眼，为显性突变；这样两条不同的X染色体都有了细胞学的标记，可供镜检分辨。 • 在杂交后代中，不仅可以看到表型（眼色和眼形）的重组，同时在显微镜下还可以观察到带有标记染色体的重组。这两种重组又完全一致，从而证实了基因重组是交换的结果。 • 在克莱顿和麦克林托克的结果发表没几周，斯特恩(Stern，C.)又发表了果蝇实验的证据，和玉米实验有异曲同工之妙。这条X染色体缺失了一个片断。 • 斯特恩选择带有异型同源染色体的雌果蝇为材料。此果蝇的一条X染色体上带有两个突变基因。雄性果蝇的X染色体上带有car和非棒眼基因，雄性是完全连锁的。

6.2.2 果蝇实验

6.3 交换和重组值 • 染色体内重组是交换的结果，但交换不一定导致重组。因为我们是依据标记基因来判断是否重组的，若在两个标记基因之间发生奇次数交换，结果必然导致重组，但若发生偶次数交换，标记基因并不重组。

6.3 交换和重组值 • 不能进行自由组合的基因群则称之为连锁群（Linkage group），排列在同一条染色体上及其同源染色体上的基因同属于同一连锁群。 • 一种二倍体生物的连锁群数应和其染色体对数相等。 • 在少数的生物中如雄果蝇和雌家蚕都不发生重组，人们称之为完全连锁。 • 1922年英国的霍尔丹（Haldane, J.B.S）提出：凡是较少发生交换的个体必定是异配性别个体，此就称为霍尔丹定律。 • 为什么在雄果蝇和雌家蚕中不会产生重组呢？根据细胞学的观点，发现在减数分裂中没有交叉，也看不到联会复合体。那么在减数分裂中性染色体如何配对又如何精确分离呢？这一机制尚待进一步研究。

6.3 交换和重组值 • 根据交换发生的随机性，我们可以说，距离越长，发生交换的机会越多，因此交换值（crossing-over value）的大小就可以用来表示基因间距离的长短。但我们无法直接测定交换率，只有通过标记基因的重组来估计交换的频率。

6.3 交换和重组值 • 由于有时虽发生了交换（如双交换），但没有导致重组，因此重组值（recombination value）并不完全等于交换值，而是重组值交换值。重组值或重组率（recombination frequency）P d（两个标记基因间距离的估计数）， • P=[重组合∕(亲组合＋重组合)] 100％ • 单位是图距单位m.u.（map unit）或厘摩（centimorgan cM） • 重组值和实际图距的关系也反应了重组值和交换值之间的关系。

6.3 交换和重组值 • 重组值和实际图距的关系可以用Haldane的图谱函数来表示。 • Haldane的图谱函数是：P = ½(1－e-2d) • 式中P是重组频率，d是图谱距离，e是自然对数的底（e＝2.71828）。在此函数中，假设没有干涉，这只是对较大的染色体图距是有效的。

6.3 交换和重组值 • 从图中我们可以看出：按Heldane函数作出的曲线，（1）在图距10以内曲线近似直线，斜率接近于1，重组率几乎等于交换率，可以直接看作是图距。

6.3 交换和重组值 • （2）当图距大于10时，重组率总是小于交换率，不能直接看作为图距，必须加双交换的值予以校正，或者用Heldane函数来计算。

6.3 交换和重组值 • （3）重组率最大值不可能超过50％。 • 无论染色体上两点距离如何大，一次交换只可能发生在同源染色体的两条染色单体之间，另外两条单体并未发生交换，即使是每个初级性母细胞都如此，重组率也只有50％。

6.3 交换和重组值 • Fig. 15.5 Demonstration that the recombination frequency between two genes locatedfar apart on the samechromosome cannot exceed 50 percent

6.4 基因定位和遗传作图 • 基因定位（gene mapping）是指将基因定位于某一特定的染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺序与距离。 • 基因定位的目的是通过将基因定位到染色体的基因座上，以帮助我们理解和开发生物性状的遗传性质，特别是通过遗传连锁将一种性状的遗传与另一种性状或标记相联系，或者通过将表型差异与染色体结构的改变联系起来。这在商业上可用于改良动植物的性状、定位和克隆人类的疾病基因等。

6.4 基因定位和遗传作图 • 我们已经知道两个基因之间的距离可以通过交换值来计算，交换值又可以通过新组合在整个后代中的比率来计算，也就是说我们可以依据交换值来对基因进行定位，当然这种定位并不是一种绝对的位置，而是指基因在染色体上的排列次序和彼此之间的相对距离。下面我们来学习基因定位的基本方法。

6.4.1 两点测交 • 两点测交(two-point testcross)是指每次只测定两个基因间的遗传距离，这是基因定位的最基本方法。 • 例如我们已经知道玉米粒糊粉层有色C(或无色c)、胚乳饱满Sh(或凹陷sh)，胚乳非糯性Wx(糯性wx)这三对相对性状表现连锁遗传，它们位于同一对同源染色体上。 • 因为利用两点测交法，每次只能测定两个基因位点间的相对距离，要测定这三个基因位点之间的距离和顺序，我们需要分别进行如下的三次杂交和三次测交。

6.4.1 两点测交 • 在这里要注意的是用于测交的F1必须是双杂合体，否则无法检出重组，之所以用隐性纯合体进行测交，是因为隐性纯合体只产生一种配子，且它们的基因型在F2代中不干扰F1配子的表达，F1所产生配子的种类和比例在F2中能如实的反映出来。

6.4.1 两点测交 • 下面我们先来研究C和Sh这两对基因的遗传情况，将有色饱满粒的植株(C Sh / C Sh)与无色凹陷粒的植株(c sh / c sh)杂交，F1代(C Sh / c sh)与双隐性纯合体(c sh / c sh)测交，结果如下： C Sh/C Sh  c sh/c sh  C Sh/c sh  c sh/c sh  C Sh/c sh c sh/c sh C sh/c sh c Sh/c sh 4032 4035 149 152

6.4.1 两点测交 • 根据测交后代各类型的数目，算出互换率： • [(152+149)/(4032+4035+149+152)]100% = 3.6%, • 因此C与Sh之间的图距为3.6cM。

6.4.1 两点测交 • 对于Wx和Sh，同样： wx Sh/wx Sh  Wx sh/Wx sh  wx Sh/Wx sh  wx sh/wx sh  wx Sh/wx sh Wx sh/wx sh wx sh/wx sh Wx Sh/wx sh 5885 5991 1531 1488 • 交换率为20%，即Wx与Sh间的距离为20cM。

6.4.1 两点测交 • 这样根据上面两个实验结果，这三个基因的关系可有下列两种不同的排列方式： • 那么Wx和C之间的图距应为(20+3.6)还是(20-3.6)呢？ • 还需第三次杂交和测交才能确定。

6.4.1 两点测交 • 第三次杂交和测交： Wx C/Wx C  wx c/wx c  Wx C/wx c  wx c/wx c  Wx C/wx c wx c/wx c Wx c/wx c wx C/wx c 2542 2716 739 717 • 交换率为22%。在这里Wx和C之间的距离22更接近23.6而不是16.4，故认为第一种排列顺序更符合实际，至于为什么会有一定的差异，在后面将进一步讨论。

6.4.1 两点测交 • 两点测交的缺点： • （1）工作量非常大，并且由于环境或基因间的影响，使得测定结果会发生偏差； • （2）在两点测交中，无法检出双交换，因为在两个基因之间双交换的结果等于没交换（如图）， • 比如，要确定三个基因位点的排列顺序和遗传距离，需要进行三次杂交和三次测交，如要确定4对基因，则需6次杂交和6次测交，要是有n对基因呢？图两个基因之间双交换的结果等于没交换

6.4.2 三点测交 • 三点测交(three-point testcross)是通过一次杂交和一次测交，同时确定三对等位基因（即三个基因位点）的排列顺序和它们之间的遗传距离，是基因定位的常用方法。 • 用三点测交能测出双交换，因此更能准确地反映出连锁基因间的相对距离。 • 同样，在做三点测交时需要用这三个基因的杂合子(abc/+++，或ab+/++c，或a++/+bc等)同这三个基因的隐性纯合子(abc/abc)测交。

6.4.2 三点测交 • 例：假如用于三点测交的两个亲本为：+ + + / + + +和c sh wx / c sh wx，则F1代的基因型为：+ + + / c sh wx，然后F1与三隐性纯合体c sh wx / c sh wx测交，获得如表6-1的结果。

6.4.2 三点测交 • C-Sh间的重组值： • C-Sh = (98+107+39+19)/6033 = 4.36%。 • Sh-Wx的重组值： • Sh-Wx = (672+662+39+19)/6033 = 23.07% • C-Wx间的的重组值： • C-Wx = (98+107+672+662)/6033 = 25.51%。 • 根据这三个数据我们可以将这三个基因作如下的排列：

6.4.2 三点测交 • 很明显，25.51  4.36 + 23.07。为什么呢？ • 在两个基因之间如果发生双交换，从表型上是检测不出来的，也就是说双交换的结果等于不交换。 • 回到表6-1，其中（39+19）个个体分别在计算C-Sh和Sh-Wx之间各用了一次，说明有（39+19）的个体是发生了双交换，但是我们在计算C-Wx间的图距时，没有将这个双交换值算进去，显然C-Wx间的图距被缩小了，因此我们必须对这一结果进行校正。

6.4.2 三点测交 • 双交换值：（39+19）/ 6033 = 0.96%。 • 由于一次双交换实际上包含了二次单交换，所以在计算C-Wx间图距时，应加上2倍双交换值，即 • C-Wx = 25.51+20.96 = 27.43。 • 这样，27.43就等于4.36+23.07了。

6.4.2 三点测交 • 从任何一个三点测交的结果中，我们可以发现，F2代的8种表型中，最多的2种是亲组合，最少的2种的双交换产物，中间数量的4种是单交换的产物。 • 根据这些规律，不计算重组值就能判断三个基因的排列次序，即用双交换类型与亲本类型相比较，改变了位置的基因就是处于中间位置的基因。在上面的例子中：

6.4.2 三点测交 • 只有当Sh位于中间的时候，同时发生两个单交换才可能产生+ sh +或c + wx的个体，所以这三个基因的顺序是c-sh-wx。 • 上面的结果用图6-2表示后就更为清晰。图6-2

6.4.2 三点测交 • 根据概率知识，对同一染色体上的三个基因来说，发生双交换的概率应该是两个单交换概率的乘积。 • 在上面的例子中，理论上双交换率应为：23.07%  4.36% = 1.0%，可是它的实际双交换值只有0.96%，实际双交换值小于理论双交换值。 • 在这里实际值与理论值相差不是很大，而在有些例子中，理论双交换值与实际双交换值相差很大，譬如说理论双交换值为0.90%，可实际只有0.15%。

6.4.2 三点测交 • 可见每发生一次单交换时，它的邻近基因间也发生一次交换的机会就会减少，这种现象称为干涉(interference)。 • 干涉的程度通常用并发系数(coefficient of coincidence, c)来表示： • 并发系数(c) = (实际双交换值)/(理论双交换值) • 其中理论双交换值为两个单交换百分率的乘积。

6.4.2 三点测交 • 并发系数在0-1之间。如果并发系数=1，则说明两个单交换之间没有干涉；如果并发系数=0，则说明发生了完全干涉，也就是说第一个交换的发生完全干涉了第二个交换的发生，即没有双交换。 • 在上面的例子中，并发系数 = 0.96/1.0 = 0.96, 干扰 = 1 - 0.96 = 0.04。 • 另外在微生物发生基因转变的时候，并发系数可以大于1，这表示存在负干涉(negative interference)，即一次交换的发生使第二次发生交换的频率增加了。

6.4.2 三点测交 • 以上讲的干涉是就一个完整的染色体为单位来说的，也叫染色体干涉(chromosomal interference)。我们知道，在减数分裂的前期，二价体是由4条染色单体组成的，交换并不限于某二条非妹妹染色单体之间，因而存在1-3、1-4、2-3、2-4各种不同形式的交换 (图)。

6.4.2 三点测交 • 第一次交换发生后，第二次交换可在任意两条非姊妹染色单体间进行(A,B,C,D)； • 一般情况下，第一次交换除对同线双交换有干涉外，对其他双交换没有干涉。

6.4.2 三点测交 • 遗传学图(genetic map)又称基因连锁图（linkage map）或染色体图（chromosome map），是一种依据基因之间的交换值（或重组值），表示连锁基因在染色体上相对位置的简单线性示意图。 • 通过一系列的三点测交或二点测交，我们可以把一对同源染色体上各基因的次序及相对距离标定出来，从而构成一个基因的连锁群。

6.4.2 三点测交 • 一个连锁群（linkage group）是指位于一对同源染色体上的所有基因群。 • 一个生物连锁群的数目等于或少于染色体的对数。 • 图6-4是果蝇的遗传学图，4个连锁群正好与4对染色体数相符。 • 基因在遗传学图上的位置叫座位(locus)，一般以最先端的基因位置为0，如果发现有新基因在更先端的位置时，就把0点让给新基因，其余基因的位置亦作相应的移动。

第 6 章 真核生物的基因作图