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第二章 基因工程的酶学基础

第二章 基因工程的酶学基础. Enzymes. 本章节内容. 第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA 聚合酶 第四节 DNA 修饰酶 第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶. 本章学习内容. 重点讨论限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶在 DNA 切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。. 第一节 限制性核酸内切酶. 一、限制性核酸内切酶. （ Restriction endonuclease ）.

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第二章 基因工程的酶学基础

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Presentation Transcript

  1. 第二章 基因工程的酶学基础 Enzymes

  2. 本章节内容 第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶第四节 DNA修饰酶第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶

  3. 本章学习内容 重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。

  4. 第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

  5. 1. 来源 主要来源于原核生物 2. 性质 内切酶 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端 3. 功能 自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）

  6. （1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。

  7. （2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基

  8. （3）限制与修饰系统相关的三个基因 ① hsd R: 编码限制性内切酶 这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断 ② hsd M: 编码限制性甲基化酶 这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。 ③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达 作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。

  9. 二、限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： • 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示

  10. 2.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。2.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。 如 Hind Ⅱ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒

  11. 3.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。3.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶 4.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。 如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶 实际应用中，R常被省略。

  12. 三、限制性内切酶的类型 目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的三种： Ⅰ型限制性内切酶 Ⅱ型限制性内切酶 Ⅲ型限制性内切酶

  13. 1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性 首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC

  14. （2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大 Recognize site cut 1-1.5kb （3）辅助因子 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）

  15. 2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ 基因工程用途最大 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。 与DNA的来源无关，即没有种的特异性。

  16. 稀有切割限制酶（rare cutter） 可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。 如NotI（GCGGCCGC） 某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。 如Hind Ⅱ可识别4种核苷酸序列： Y: C或T R: A 或G 5’- GTYRAC -3’

  17. （2）切割位点 识别位点处 切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：

  18. [1] 粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ⅰ） 5’端凸出（如EcoR I切点） 5’- GAATTC -3’ CTTAAG 3’- -5’ 5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’

  19. ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点） 5’- CTGCAG -3’ 3’- -5’ GACGTC 5’- CTGCA G -3’ 3’- -5’ GACGTC

  20. [2] 粘性末端的意义 ① 连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易得多。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

  21. ② 末端标记 A末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。

  22. [3] 平齐末端（blunt end） 在识别序列的对称轴上同时切割 如EcoR V 5’- GATATC -3’ 3’- CTATAG -5’

  23. [4] 平齐末端的特点 连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。 粘性末端与平齐末端连接的处理方法 ⅰ）添补法： 利用DNA聚合酶Ⅰ (klenow fragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。

  24. ⅱ）削除(平)法 利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端

  25. [5] 同裂酶（Isoschizomer) 不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。 ① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同 如Hind Ⅲ和Hsu I Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’

  26. ② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。

  27. [6] 同尾酶(Isocaudamers） 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、BglⅡ、Bcl I、Xho Ⅱ等 BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Bgl Ⅱ Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’ XhoⅡ U代表嘌呤；Y代表嘧啶。

  28. Sau 3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 GATCT-3’ A-5’ 5’-G 3’-CCTAG BamH I Bgl Ⅱ 5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ Bgl Ⅱ BamH I Sau 3A

  29. [7] 限制酶的酶活性 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。

  30. 使用的时候要特别注意！ EcoR I和BamH I等都有*活性。 EcoR I： GAATTC 在低盐、高pH（>8）时可识别和切割 GAATTA、AAATTC、GAGTTC等 7

  31. ② 诱发星号（*）活性的原因 ⅰ）高甘油含量 ⅱ）内切酶用量过大 ⅲ）低离子强度 ⅳ）高pH ⅴ）含有机溶剂，如乙醇 ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在 酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件

  32. [8]Ⅱs型限制性内切酶 移动切割（shifted cleavage): 在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。 Hga I 5’ GACGCNNNNN 3’ CTGCGNNNNNNNNNN

  33. （3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能 Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。 它们识别相同的DNA序列，但功能不同。 如 EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶 前者：5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 后者：5’-GAA*TTC-3’ 3’-CTT*AAG-5 作用的位点也不相同

  34. （4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割 定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低 如：HhaⅠ切割单链DNA比 切割双链DNA效率低50％

  35. 3. Ⅲ类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。

  36. 核酸限制性内切酶的类型及主要特性

  37. 四、限制性内切酶酶解反应条件 1. 标准酶解体系的建立 一个单位（U）的限制性内切酶定义： 在合适的温度和缓冲液中，在20μl的反应体系中，1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。 推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间

  38. 2. 酶解过程 配酶解体系 混匀 反应终止 酶解结果鉴定

  39. ① 酶解体系 一般20μl，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。 加样顺序一般是： ddH2O buffer DNA 酶

  40. Tris-HCl 50 mM pH 7.5 0 - 50 mM 低盐酶 MgCl2 10 mM 100 mM 中盐酶 NaCl 0 - 150 mM DTT 1 mM 150 mM 高盐酶 Volume 20 - 100 ml T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr • 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：

  41. ② 混匀 移液枪吹打或手指轻弹管壁 若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。 混匀后微量高速离心机进行短 暂离心，使管壁液体全部下沉。

  42. ③反应终止 三种方法： ⅰ）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（SDS） 至终浓度0.1%(W/V) ⅱ）65℃加热20min或者70℃加热10min ⅲ）酚/氯仿抽提

  43. ④ 酶解结果鉴定 快速进行微型琼脂糖凝胶电泳 观察 然后决定是否终止反应

  44. 酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带 • 酶存在“星号”活性，造成非特异性切割； • 不正确的操作，导致其它内切酶污染； • 底物DNA中可能存在其它DNA污染。 电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常 • 底物DNA不纯； • 内切酶不纯； • 酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常

  45. （1）内切酶与识别序列的结合模式 3. 限制性内切酶对DNA分子的消化 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现Ⅱ型限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。 GAATTC CTTAAG

  46. （2） 完全消化 内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开 1 3 2 4 1 2 3 4

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