蛋白用于三元复合基因载体

1. 蛋白用于三元复合基因载体 宋玉华 2012207474 化学工程

2. 基因治疗 蛋白三元复合基因载体 非病毒载体

3. 基因治疗 治疗性蛋白 基因物质 特定细胞 裸DNA带负电，很难单独进入细胞，而且容易被血清中的核酸酶降解 寻找 载 体

4. 免疫原性、插入诱变 病毒载体 低毒、低免疫反应，外源基因随机整合 率低且携带基因大小类型不受限制 非病毒载体 聚阳离子 脂质体

5. 阳离子脂质体或聚阳离子与DNA组装形成的二元复合物带有过量正电荷，易与血清中带负电的蛋白质非特异性结合阳离子脂质体或聚阳离子与DNA组装形成的二元复合物带有过量正电荷，易与血清中带负电的蛋白质非特异性结合 不 足 将蛋白作为第三元物质来屏蔽过量正电荷 形成蛋白/阳离子脂质体或聚阳离子/DNA三元复合物

6. HSA/阳离子脂质体/DNA 本文采用HSA与阳离子脂质体、DNA进行三元复合。 开始，增加HSA含量，荧光素酶含量提高。进一步提高HSA含量荧光素酶的表达会降低，这是因为降低了DNA与阳离子脂质体结合的数量。 32μgHSA是转染最佳量 S. Simoes et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1463 (2000) 459~469

7. Transfection by HSA-lipoplexes in vivo. HSA-lipoplexes, plain lipoplexes (both at a charge ratio (+/3) of 2/1 and containing 100 Wg pCMVluc), or naked DNA were injected into mice via the tail vein in a volume of 200 Wl. Luciferase gene expression in the lungs and spleen was measured 8 h following injection, and is given as pg luciferase/mg organ. Each bar represents a di¡erent animal. Note that luciferase expression by naked DNA was too low to be apparent at this scale. 在肺细胞和肾细胞中，三元复合物的转染效率高于裸DNA,和二元复合物的转染效率。 另外，通过调节细胞内吞作用,白蛋白可以促进脂质体转染。白蛋白还可以作为膜融合蛋白，在酸性条件下降低破坏内涵体，来提高细胞内的基因传递。

8. HOWEVER 脂质体价格较贵，不经济 容易合成 结构与性能易 调整 聚阳离子 DNA负载能力大 价格低

9. HSA/PEI/DAN三元复合 Degradation profile of naked DNA (—○—) and HSA–PEI–DNA nanoparticles (N/P56, —□—). HSA–PEI–DNA nanoparticles containing 50 mg/ml DNA or a solution of 50 mg/ml naked DNA were incubated with 10 units of DNase I, respectively. The change in absorbance at 260 nm was monitored during 30 min of digestion at 25 ℃. Transfection of human epithelial kidney 293 cells. HSA–PEI–DNA nanoparticles (N/P56) containing pGL3 plasmid were compared to commercially available transfection reagents. Dose ofDNA was 10 mg/ well for each preparation. Cells were incubated with HSA–PEI–DNA nanoparticles for 4 h in the presence of10% serum. The level of gene expression was evaluated bymeasurement of luciferase activity. The data are expressed as relative light units (RLU) per 500 000 cells. 三元复合物与市售的转染试剂相比，转染效果等级相当，但是市售的转染试剂细胞毒性大，很少用于体内。 DNA复合进纳米微粒基质中，有效 地保护其不受DNA酶的降解。 Human serum albumin–polyethylenimine nanoparticles for gene delivery. Journal of Controlled Release

10. 细胞毒性测试表明在任何N/P比下，HSA/PEI/DNA三元复合物对细胞的毒性都要明显的小于PEI/DNA二元复合物，细胞存活率可以达到80%以上。细胞毒性测试表明在任何N/P比下，HSA/PEI/DNA三元复合物对细胞的毒性都要明显的小于PEI/DNA二元复合物，细胞存活率可以达到80%以上。 Effect of different N/P ratios of HSA–PEI–DNA nanoparticles (hatched bars) and PEI–DNA complexes (black bars) on the viability of 293 cells. The MTT dye reduction assay was performed 48 h after incubation of the cells with the same amount of the preparations as in the transfection trials. 这说明表面带有正电荷的二元纳米复合颗粒能与带负电的细胞表面非特异性结合，激活补体系统，对其产生免疫作用。同时这更加明确地表明在三元复合物中，HSA能够有效的屏蔽纳米微球表面的正电荷，从而减少了对细胞膜的毒害作用。 较少的表面电荷降低了吞噬细胞对纳米粒子的摄取作用，延长了粒子的循环时间。 Human serum albumin–polyethylenimine nanoparticles for gene delivery. Journal of Controlled Release

11. HSA enhances PEI-mediated transfection. 9HTEo-(A) and A549 (B) cells were plated onto 24-well plates at 100 000and 50 000 per well, respectively, to obtain 90–100% confluency after 2 days of culture. Cells were incubated with 1 μg of pCLuc complexed with PEI (10N/P) with HSA over a range of albumin amounts (expressed in μg on the x-axis) in a total volume of 1 ml. Twenty-four hours after transfection, cells were lysed and cell lysates were tested for luciferase activity, expressed as relative light units (RLU) per μg of protein content. Values represent the mean (±SEM) of three experiments conducted in duplicate 随着蛋白含量的增加，HSA/PEI/DNA三元复合物的荧光素酶的表达提高近100倍。 产生绿色荧光蛋白 表达的细胞 增加了好几倍 J Gene Med 2005; 7: 1555–1564.

12. 受体调节机制的限制，转染效率在蛋白数量高到一定程度时就不再提高。受体调节机制的限制，转染效率在蛋白数量高到一定程度时就不再提高。 在二元复合物表面结合的白蛋白越多，与细胞之间的作用就越强，转染效率也就越高。

13. BSA/PDMA/DNA三元复合物 以牛血清白蛋白（BSA）作为大分子引发剂，通过原子转移自由基聚合反应，把带正电荷的聚二甲氨基-甲基丙烯酸乙酯（PDMA）与BSA共轭复合成BSA-PDMA纳米微粒。 BSA/PDMA/DNA三元纳米微粒 形成的直径平均为50nm 受BSA保护纳米微粒表面的正电荷，三元复合物顺利的进入细胞，通过观测到红色荧光在内涵体中没有共区域化，表明复合物能够逃离内涵体，可以在细胞内转移。 Biomacromolecules 2011, 12, 1006–1014

14. 在不同细胞类型，随着N/P比增大，蛋白表达均提高。在不同细胞类型，随着N/P比增大，蛋白表达均提高。 不同N/P比下绿色荧光测试

15. BSA/PPD/DNA三元复合物 通过转移自由基聚合反应，将聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯（PDMAEMA）形成接枝型聚阳离子PPD。当N/P大于等于3时，PPD能够完全压缩DNA形成PPD/DNA二元纳米复合物。具有五元环内酰胺结构的PVP可以通过氢键结合DNA，掩蔽其负电荷，保护DNA不被酶降解，从而提高了DNA的稳定性。 B. Zhang et al. / Journal of Biomaterials Science 0 (2012) 1–16

16. 三元复合物BSA/PPD/DNA没有毒性，在HepG2细胞中具有较高的转染效率。随着BSA含量的增加，转染效率只是轻微的有些下降。三元复合物BSA/PPD/DNA没有毒性，在HepG2细胞中具有较高的转染效率。随着BSA含量的增加，转染效率只是轻微的有些下降。

17. Cytotoxicity and transfection efficiency in vitro. (a) Cell viabilities of HepG2 cells treated by BSA/PPD-1/pDNAcomplexes (the N/P ratio of the PPD-1/pDNA binary complexes is 15) with the increase of BSA concentrations determined by MTT assay. Experiments were performed in triplicate; values represent the relative viability compared to untreated cells as means ± SEM of one representative experiment (n = 3). (b) The transfection efficiencies of BSA/PPD-1/pDNA complexes (the N/P ratio of the PPD-1/pDNA binary complexes is 15) with the increase of BSA concentrations in HepG2 cells determined by flow cytometry. Experiments were performed in triplicate; values represent the EGFP-positive cells as means ±SEM of one representative experiment (n = 3). (c) Fluorescence images of HepG2 cells. (c1, c2) PPD-1/pDNA binary complexes at a N/P ratio of 15 and BSA/PPD-1/pDNA ternary complexes (the concentration of BSA is 7.5 μg/ml), respectively. 在含有10%血清的HepG2细胞中，BSA/PPD/DNA三元复合物的转染效率高于PEI，但细胞毒性要小的多 说明 BSA显著的改善了基因载体的性能， 更有利于传递DNA。

18. Ⅰ型胶原蛋白/PEI/DNA 利用Ⅰ型胶原蛋白与PEI/DNA复合形成三元复合物。与去端肽胶原蛋白相比，该三元复合体系在NIH/3T3细胞株和骨髓基质细胞株中的转染效果明显高很多。这说明Ⅰ型胶原蛋白也是可以有效地与聚阳离子/DNA进行三元组装，提高基因传递效率。 Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2010, 10(5): 3170-3174.

19. 结 论 相比于聚阳离子/DNA二元复合物，利用蛋白、聚阳离子与DNA复合形成的三元复合物能够有效地提高细胞的转染效果，降低细胞毒性，从而提高基因表达。 发展方向： 该体系在细胞内的具体转染机制仍然未研究透彻，这就使得人们不能从最根本的机理出发，改善它们的性能，进一步提高它们的基因传递能力，以及对人体各种细胞的适应性。这是研究的主要方向。

20. 谢 谢 ！