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实验二

实验二. 实验内容 1. 观察上次实验结果 2. E 花环形成试验（ EAC ） 3. 免疫荧光（示教）. 试管法　 实验结果及判定. 不要摇动试管，先观察管底有无凝集物。对照管 ( 第 8 号管 ) ，液体浑浊，管底有细菌沉淀物，形成边缘整齐、光滑的小圆块，轻轻摇动试管，圆块便分散成均匀浑浊的悬液。 从第 l 号至第 7 号管依次观察。Ｏ菌液阳性管可见管底边缘不整齐的凝集物，如轻微振摇试管颗粒状凝块可悬浮起来，不易摇碎。 (H 菌液，则为絮状沉淀物，轻摇易碎 ) 。阴性管则与对照管 ( 第 8 管 ) 相同。. 　　　结果记录方法；

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Presentation Transcript

  1. 实验二 • 实验内容 1.观察上次实验结果 2.E花环形成试验（EAC） 3.免疫荧光（示教）

  2. 试管法　实验结果及判定 • 不要摇动试管，先观察管底有无凝集物。对照管(第8号管)，液体浑浊，管底有细菌沉淀物，形成边缘整齐、光滑的小圆块，轻轻摇动试管，圆块便分散成均匀浑浊的悬液。 • 从第l号至第7号管依次观察。Ｏ菌液阳性管可见管底边缘不整齐的凝集物，如轻微振摇试管颗粒状凝块可悬浮起来，不易摇碎。(H菌液，则为絮状沉淀物，轻摇易碎)。阴性管则与对照管(第8管)相同。

  3. 　　　结果记录方法； • ++++：完全凝集，细菌全部凝集，凝集块完全沉于管底，液体澄清。 • +++：绝大部分细菌凝集，凝集块沉于管底，液体稍浑浊。 • ++：细菌部分凝集，管底凝集物较前者少，但仍明显，液体半澄清。 • +：凝集物极少，需仔细观察才能发现，液体浑浊。 • 一：无凝集，液体的浑浊度与阴性对照管相同。 • 取++的最高稀释度为该免疫血清的凝集效价。

  4. 双向琼脂扩散试验 实验结果及判定 • 在两孔之间出现一清晰致密白色沉淀线与已知阳性对照的沉淀线发生融合者为阳性反应。若72小时后仍未出现沉淀线则为阴性反应。如图。

  5. 加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。

  6. 定性实验 常用于检测两种抗原的相关性

  7. 三孔型双向免疫扩散可能的结果

  8. E花环形成试验（EAC） 实验目的 • 1．掌握E花环形成实验的原理及操作方法。 • 2．了解E花环形成实验的临床意义。

  9. 实验原理 • E花环形成试验是根据人的T细胞表面有绵羊红细胞受体－－E受体(E即红细胞rythrocyte)，在一定条件下能与绵羊红细胞(SRBC)结合，绵羊红细胞吸附于T细胞周围，形如玫瑰花环,因而得名。 • 此试验既能计数T细胞，又能反映T淋巴细胞活性,从而可以判定机体细胞免疫水平。

  10. 实验材料 • 1．试管(含肝素)。 • 2．淋巴细胞分层液。 • 3． Hank's液。 • 4．1％压积SRBC。 • 5．小牛血清(56℃30分钟灭活并经SRBC吸收)。 • 6．无菌试管，注射器。 • 7． Wright—Giemsa染液。 • 8．离心管、吸管、毛细管、载物玻片、盖玻片、离心机、显微镜等。

  11. 实验方法 1．无菌采集静脉血lml注入盛有肝素的试管中。立即摇匀使血液抗凝。 2．将肝素抗凝血沿管壁徐徐加入已装有2ml淋巴细胞分层液的试管中，使稀释血液重叠 于分层液之上，保持界面清晰 （勿使两液相混 ）。 3．离心：2000r／min离心20分钟。 4．洗涤：用毛细管轻轻吸出淋巴 细胞层（位于分层液及血浆交界处 的灰白层）到另一试管中，加5倍 体积的Hanks液洗涤，2500r／min 离心5分钟，共3次。

  12. 5 ．活化：去掉上清，留取管底沉淀 (即PBMC)0.2～0.3ml混匀后，吸取0.1ml注入已放有0.1ml小牛血清的小试管内，置37℃水浴五分钟(小牛血清可提高E花环形成率,且使反应稳定)。 • 6．结合：取1％ SRBC0.1ml加入上述小试管内，轻轻摇匀，再以1000r／min离心一分钟，然后放4℃冰箱二小时。 • 7.涂片：弃掉少量上清，取沉淀细胞涂片，自然干燥。 • 8.染色：用Wright—Giemsa染液覆盖涂膜，滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。经5分钟后，用蒸馏水洗净。 • 9. 干燥后用油观察。

  13. 实验结果 • 在显微镜下，淋巴细胞呈蓝色，SRBC红色(或五色)，一个淋巴细胞周围凡吸附三个或三个以上SRBC即为E花环形成，计数200个淋巴细胞，求出花环形成百分率。 注意事项 • 1．分离淋巴细胞时，离心机启动应缓慢加速。 • 2．吸取淋巴细胞时，不宜将灰白层下的液体取出过多。

  14. 免疫荧光试验（示教）直接法——B淋巴细胞Smlg荧光抗体检测法免疫荧光试验（示教）直接法——B淋巴细胞Smlg荧光抗体检测法

  15. 实验目的 • l.熟悉B淋巴细胞荧光抗体检测法的原理。 • 2.观察免疫荧光染色的细胞的形态、类型。 • 3.掌握Smlg阳性的细胞在荧光显微镜下的形态特征。 • 4.学习使用荧光显微镜。

  16. 实验原理 • 利用荧光素标记的抗IgM抗体在一定条件下与B细胞表面SmIgM特异结合，结合于细胞表面的荧光素，在一定波长光激发照射下，发出一定波长的荧光，借此可用荧光显微镜或流式细胞仪检测到与荧光抗体特异性结合的B细胞表面标志。 • 由于每一个B淋巴细胞表面可携带不同类的Smlg，如 SmlgM、SmlgA等，若分别用单价荧光抗Ig血清染色，则可鉴别出带不同Smlg的B淋巴细胞。 • 凡与荧光标记抗体结合的细胞，在荧光显微镜下，细胞膜呈现荧光，即为Smlg阳性细胞(B淋巴细胞)。如同时用普通光源照明，记数该视野中的淋巴细胞总数，便可算出Smlg阳性细胞或带各类SmIg细胞的百分数。

  17. 实验材料 • 1.用异硫氰酸荧光素标记的兔或羊抗人Ig血清. • 2.待检者肝素抗凝静脉血. • 3.含5％胎牛血清的HanK's液. • 4.比重为1.077+-0.001的淋巴细胞分离液. • 5．载玻片：；盖玻片、毛细滴管、试管、荧光显微镜、离心机、计数器等.

  18. 实验方法 1．小白鼠颈椎脱臼处死，取脾、制备脾细胞悬液1× 106/ml。 2．将1ml脾细胞悬液加入EP管内，2000rpm 3min离心，弃上清，加入FITC-IgG 100μL, 置于4℃,30min。 3．洗涤2次，去除游离的抗体，最后一次离心留少许回流液，混匀滴片镜检。

  19. [实验结果及判定] • 在荧光显微镜下观察时所见到的发出明显荧光的细胞应为B淋巴细胞 • 凡呈现微弱、均匀一致的暗淡荧光者为荧光阴性细胞，即非B淋巴细胞。凡细胞呈现较强荧光，有明显细胞轮廓，细胞荧光可呈点状、环状和帽状三种类型即为Smlg阳性细胞即B淋巴细胞。

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