综合性设计性实验 -6

1. 综合性设计性实验-6 • 质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息学分析 • 质粒DNA的提取与鉴定 • 真核表达载体和RNA干扰载体的使用

2. 此实验共包括如下三个部分 • 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列生物信息学分析部分 • 第二部分，质粒DNA的提取与鉴定实验操作部分 • 第三部分，真核表达载体和RNA干扰载体的使用

3. 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息学分析第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息学分析

4. 质粒的基本知识 • 载体（vector）：能携带外源DNA进入细胞的运载DNA分子。载体按其行使的功能分为克隆载体和表达载体，按组成元件的来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。 • 质粒（plasmid）大小在1kb～200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。

5. 质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。 • 质粒含有启动子序列，能够自我复制。不过质粒的复制和转录都依赖于宿主编码的蛋白和酶，或能在胞质中进行自我复制，或整合到细胞染色体中作为细胞遗传物质的一部分随染色体一起复制。 • 质粒的特点使其成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。

6. 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。 • 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。

7. 以应用于毕赤酵母表达系统的pPIC9载体为例解释载体的构件以应用于毕赤酵母表达系统的pPIC9载体为例解释载体的构件 • 5‘AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达； • α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化； • 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点； • TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； • HIS4为营养缺陷型筛选标志； • 3‘AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组； • 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在 E.coli 中筛选和复制。

8. 根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 • 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细菌内大量复制，得到大量的重组质粒。 • 常用的克隆载体有： pGEM-T, pBR322, pUC18/19 • 表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。 • 常用的表达载体： • 原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列 • 酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ • 真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP， CMV4，pEGFT-Actin

9. 序列的查询与获得 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

10. 输入基因名称 • 选择查询项目 • 点击“Go”

11. 注意选择人属物种的基因

12. mRNA序列 蛋白质序列 基因组序列

14. 运行DNAstar软件

15. 点击“OK” 选取编码区序列

16. 输入DNA序列 得到的分析结果 密码子使用分析 http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html

17. http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/ http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html 启动子区的分析

18. CpG岛分析 http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2943

19. 第二部分，质粒DNA的提取与鉴定 实验目的 • 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理

20. 质粒DNA的提取方法 • 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。碱裂 解法有操作简便、快速、得率高的优点。 • 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 • 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。

21. 碱裂解法基本原理 • 葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性，避免质粒被酶降解。 • NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 • 溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。 • 75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase。

22. 在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。 • 溴化乙锭(EB)是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

23. 限制性内切酶（restriction endonuclease）指能识别碱基构成特异的一段（4~8 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。 • 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。 • 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基基团的末端 。

24. 载体的酶切与载体的构建

25. NGAL 编码区 MCS Bgl II • 本实验所用的质粒为酵母表达载体pPIC9多克隆位点中插入了不包含信号肽序列的NGAL基因编码区，该质粒能转化至酵母菌中，由5′AOX1启动NGAL编码区的转录后翻译成蛋白，从而获得大量的重组蛋白。 • 其大小为 8000bp＋570bp＝8570bp • 酶切位点Bgl II在该质粒上有两个，分别位于质粒的第 2bp和第 5622bp处。

26. 实验操作 一 细菌培养与质粒扩增 将微量质粒转化至大肠杆菌中，挑单克隆于LB培养液中培养。 二 质粒提取 • 取1.5ml培养物倒入 Eppendorf 管中，8000 rpm室温离心1 min； • 弃去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥； • 将细菌沉淀悬浮于100 µl预冷的溶液I中，剧烈振荡，使沉淀完全分散； • 加200 µl溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf 管，温和颠倒混合6～8次；

27. 加入150 µl预冷溶液III，盖紧管口，剧烈振荡数次混匀， 冰上放置3min； 12000 rpm离心5 min，将上清液转至另一 Eppendorf 管中； • 加入等体积（400 µl）酚：氯仿溶液，混匀，12,000 rpm室温离心2 min，取上清至另一新离心管； • 向上清液加入2倍体积（约800 µl）无水乙醇，混匀后，室温放置2 min；12000 rpm 离心5 min。倒去上清液，把 Eppendorf 管倒扣在吸水纸上，吸干液体； • 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并同上离心，倒去上清液，空气中干燥5～10分钟； • 加入50 µlTE 溶液，使DNA完全溶解，短暂振荡5分钟后即可酶切（或-20℃保存）。

28. 酶切鉴定 质粒溶液 1 µl 10× Buffer H1 µl 10× BSA 1 µl Bgl II 0.5 µl 无菌水 6.5 µl 充分混匀，37 ℃水浴孵育1-2h。

29. 电泳操作 1. 凝胶准备 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TAE； ② 微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖； ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 5μl，并轻轻混匀。 2. 胶床准备 ① 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙； ② 将胶床放在调整好的水平台上； 3. 铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；

30. 水平电泳系统

31. 室温下静置1小时左右，凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极； • 向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； • 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； • 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀； • 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为10 µl；

32. 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； • 电泳条件：电压80v；时间20～25分钟； • 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 • 电泳结果分析： • ① 紫外检测仪直接观察电泳条带 • ② 摄影记录

33. Marker 6.1 kb 6 Kb 2.4 kb 2 kb 预期实验结果

34. 注意事项 • 电泳前，确认样品孔位于电场负极； • 因EB存在，全部操作过程要带防护手套； • 凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。

35. 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围

36. 质粒的测序鉴定 • 为了检查插入载体的外源片段是否与原来基因的序列一致，或发生突变的是否改变编码区的读框，是否发生两种性质差别较大的氨基酸替代，最好的方法是测序。 • 现在有很多生物公司有此项服务，可将菌体或提取的质粒邮寄过去，一个星期内就可获得测序结果。 • 可用生物软件Chromas查看测序结果，软件DNAMAN分析序列比对，观看插入载体的外源片段是否与原基因序列一致。

37. 观看测序结果的软件Chromas 软件运行界面 打开一个测序结果 峰型排列良好，无高大杂峰，说明测序结果可靠

38. 将测序结果输出为文本文件

39. DNAMAN软件运行界面

40. “Sequence”－”Alignment”－”Mutiple Sequence Alignment”

41. 从文件夹中打开序列文件

42. 采用默认比对参数

43. 注意出现不平整的地方

44. 第三部分，设计性实验部分 实验设计 • 为了研究一个基因的功能，常用过表达或敲除的方法， • 列举目前常用的真核表达载体，并对其中一个载体的构件进行详细的说明； • 列举将载体转染至细胞中的方法，并分析它们的优缺点； • 列举常用的RNA干扰载体，转染后细胞的筛选；