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一．教学内容 1. 色谱法的历史及分类 2. 色谱法的分离原理 3. 薄层色谱法 4. 纸色谱法

第十六章 液相色谱法. 一．教学内容 1. 色谱法的历史及分类 2. 色谱法的分离原理 3. 薄层色谱法 4. 纸色谱法. 二．重点与难点 1. 色谱法的分离原理 2. 薄层色谱法的基本原理及操作，定性、定量分析. 三．教学目标 1. 掌握色谱分析法的分离原理 2. 掌握薄层色谱法比移值的计算 3. 了解色谱分析法的分类 四 . 学时安排 5 学时. 第十六章 液相色谱法. 第一节 概述. （一）色谱法的历史. 俄国植物学家 Tswett 于 1901 年 发现：利用吸附原理分离植物色素. 流动相：石油醚 固定相：碳酸钙

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一．教学内容 1. 色谱法的历史及分类 2. 色谱法的分离原理 3. 薄层色谱法 4. 纸色谱法

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  1. 第十六章 液相色谱法 一．教学内容 1.色谱法的历史及分类 2.色谱法的分离原理 3.薄层色谱法 4.纸色谱法 二．重点与难点 1.色谱法的分离原理 2.薄层色谱法的基本原理及操作，定性、定量分析

  2. 三．教学目标 1.掌握色谱分析法的分离原理 2.掌握薄层色谱法比移值的计算 3.了解色谱分析法的分类 四.学时安排5学时

  3. 第十六章 液相色谱法 第一节 概述 （一）色谱法的历史 俄国植物学家Tswett于1901年发现：利用吸附原理分离植物色素 流动相：石油醚 固定相：碳酸钙 实质：使各组分得以分离。根据混合物各组分在固定相和流动相中吸附差异，使各组分在色谱柱中的迁移速度不同而获得分离。

  4. 1938年Izmailov 发明薄层色谱 1944年Consden,Gordon & Martin 发明纸色谱 1952年Martin & Synge 发明气-液色谱 1953年Janak发明气-固色谱 1957年Martin & Golay 发明毛细管色谱 1960年液相色谱技术完善 1954年我国研究成功第一台色谱仪

  5. 流动相：固体、液体 固定相：气体、液体 色谱柱：起分离作用 色谱法的实质：根据混合物各组分在固定相和流动相中 吸附、脱附、溶解、析出或其它亲和力和渗透性的差异，使 各组分在色谱柱中的迁移速度不同而获得分离。

  6. 二、色谱法的分类 1.按物理状态分类 根据流动相的物态：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC) 超临界流体色谱法 根据固定相的物态：气-固色谱法、气-液色谱法 液-固色谱法、液-液色谱法 2.按操作形式分类 (1)柱色谱法 (2)平面色谱法 (3)毛细管电泳法 3.按分离机理分类 (1)吸附色谱 (2)分配色谱 (3)离子交换色谱 (4)空间排阻色谱

  7. 三、色谱法分离原理 1.分离原理 吸附-解吸- 再吸附-再解吸的过程 吸附能力弱的的组分在柱中迁移速度快，先流出色谱柱 吸附能力强的的组分在柱中迁移速度慢，后流出色谱柱

  8. 2.分配系数与保留行为的关系 K值与组分的性质、固定相和流动相的性质及温度有关 K值小，tR小，在固定相上保留时作用弱，迁移速度快， 先流出色谱柱K值大，tR大，在固定相上保留时作用强，迁移速度慢， 后流出色谱柱 分配系数不等是分离的前提。

  9. 3.K值在四种类型色谱法中的含义 分配色谱法：K表示分配系数 吸附色谱法：K表示吸附平衡常数 离子交换色谱法：K表示交换系数 空间排阻色谱法：K表示渗透系数

  10. 四、色谱法的特点 (1)高选择性 (2)高效能 (3)高灵敏度 五、色谱法的应用 (1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。 (3)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。

  11. 第二节 柱色谱法 吸附色谱：利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。 一、 液-固吸附柱色谱法 1.分离原理 吸附-解吸- 再吸附-再解吸的过程 吸附能力弱的的组分在柱中迁移速度快，先流出色谱柱 吸附能力强的的组分在柱中迁移速度慢，后流出色谱柱

  12. 分配系数与保留行为的关系 K与组分性质，固定相和流动相的性质、温度有关。 一定条件下，K在低温下为常数， K值小，Cs小，在固定相上保留时作用弱，迁移速度快，先流出色谱柱K值大，Cs大，在固定相上保留时作用强，迁移速度慢，后流出色谱柱

  13. 结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构 表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心 要求：具有较大的吸附表面和一定的吸附能力，颗粒应有一定的细度且粒度要均匀常用吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭 2.吸附剂的选择 （1） 硅胶（SiO2·XH2O）

  14. 特性： 1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑，吸附能力↑→强极性吸附中心，不易洗脱 吸附活性次序：活泼型>束缚型>游离型 2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力 适用：分析酸性或中性物质

  15. （2） 氧化铝 碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质 硅胶与氧化铝的活性分为五级。含水量越少， 活度越大，吸附能力越强。 常用Ⅱ、Ⅲ 分离极性小的物质，选用活度大的吸附剂，吸附能 力强，以免保留程度太小，难以分离。

  16. 3.色谱分离条件的选择 （1） 被测组分性质（极性大小）： 烷烃＜烯烃 ＜卤代烃＜醚＜硝基化合物＜叔胺＜酯＜酮＜醛＜酰胺 ＜羧酸，醇 （2） 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 （3） 流动相的极性： 流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相

  17. （4） 三者关系： 组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性 流动相极性递增的次序 石油醚<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<醋酸 乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水

  18. 二、 液-液分配柱色谱法 1.原理 以液体作为固定相和流动相，利用被分离物质组分在固定相和流动相中的溶解度不同，造成分配系数上的差异而实现分离的色谱方法。 K为分配系数 K越大，保留时间越长，后流出 K越小，保留时间越短，先流出 2.载体（支持剂）：硅胶、硅藻土及纤维素等 固体相:水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等极性溶剂

  19. 3.分类：正相分配色谱法和反相分配色谱法 正相分配色谱法：流动相的极性小于固定相的极性 反相分配色谱法：流动相的极性大于固定相的极性 4.按洗脱顺序： 正相分配色谱法： 极性弱的组分先被洗脱，极性强的组分后被洗脱 反相分配色谱法： 极性强的组分先被洗脱，极性弱的组分后被洗脱

  20. 反相色谱： 固定相：石蜡油，化学键合相（如十八烷基硅胶键合相） 流动相：水、甲醇、乙腈等强极性有机溶剂 洗脱顺序：极性大，先出柱；极性小，后出柱。 应用：适合于脂溶性成分，如高级脂肪酸、油脂 正相色谱： 固定相：水、缓冲溶液 流动相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂 洗脱顺序：极性小的化合物先出柱，极性大的后出柱 应用：适用于水溶性或极性较大的化合 物，如生物碱、 苷、糖类、有机酸等。

  21. 三、离子交换色谱法： 1.原理：可交换离子与树脂上的交换基团进行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂从柱上洗脱下来，实现物质的分离。 2.固定相：离子交换树脂 （1）.分类： a.阳离子交换树脂 强酸性阳离子交换树脂（R—SO3H） 弱酸性阳离子交换树脂（R—OH） 酚羟基在pH>9.5 羟基pH>4 树脂可以再生

  22. b.阴离子交换树脂 强碱性阴离子交换树脂[R-N（CH3）+3OH-] 弱碱性阴离子交换树脂 （2）吸附规律 阳离子交换树脂——分离碱性成分 阴离子交换树脂——分离酸性成分 （3）洗脱液：稀酸或稀碱溶液

  23. （二）离子交换树脂的性能 1.交联度：树脂中交联剂的含量。以重量百分数表示。 交联度高，孔隙小，，交换速度慢。 一般选择交联度较高的树脂。 阳离子交换树脂常用8%交联度，阴离子交换树脂常用4%交联度。 2.交换容量：每克干树脂所含酸性或碱性基团的数目。 单位：mmol/g或mmol/ml 一般为1~10 mmol/g

  24. （三）离子交换平衡 KA/B>1时,说明树脂对A比对B有更大的亲和力。

  25. 树脂对离子的选择性大小： 1.离子浓度相同时，优先选择具有较高电荷的离子 2.对同价离子的亲和力，随着原子量增大而增大

  26. 四、间排阻色谱法 空间排阻色谱法也称凝胶色谱法，是一种根据试样分子的尺寸大小进行分离的色谱技术。 1.原理 空间排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。 对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积很小，小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。

  27. 2.凝胶的结构与选择 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 交联度大，孔隙小，吸水小，膨胀少，适于小分子物质的分离 交联度小，孔隙大，吸水多，膨胀大，适于大分子物质的分离 凝胶在使用前，应在流动相溶剂中浸泡，使其充分溶 胀，然后充分装入色谱柱中。

  28. 第三节 薄层色谱法 特点：分离效能高，斑点集中 灵敏度高 展开快 仪器简单，操作方便 将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而 进行色谱分离和分析的方法。 分类： 吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法 离子交换色谱法 排阻薄层色谱法 固定相为吸附剂的薄层色谱。 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。 利用被分离组分在固定相与流动相中的分 配系数不同而被分离。

  29. 一、分离原理 当流动相不断地流过吸附剂时， 由于吸附剂对不同组分有不同 的吸附力，组分在运行中会被 吸附、解吸附、再吸附、再解 吸，经过一段时间的展开，各 组分在板上的运行速度不同而 分离。

  30. 比移值与相对比移值 1. 比移值Rf(retardation factor；Rf) Rf范围： 0< Rf <1 Rf = 0.2~0.8（常用） Rf = 0.3~0.5（最佳） 2. 相对比移值Rr

  31. L0 比移值 L2 L1

  32. 例1：化合物A在薄层板上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿距原点16.2cm，（1）计算化合物A的Rf。（2）在相同的薄层色谱展开系统中，溶剂前沿距原点14.3cm，化合物A的斑点应在此薄板何处？例1：化合物A在薄层板上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿距原点16.2cm，（1）计算化合物A的Rf。（2）在相同的薄层色谱展开系统中，溶剂前沿距原点14.3cm，化合物A的斑点应在此薄板何处？ 解：

  33. 例2：样品和标准品经过薄层分离后，样品斑点中心距原点9.0cm，标准品斑点中心距离原点7.5cm，展开剂前沿距原点15cm，试求样品及标准品的Rf值和Rr值？例2：样品和标准品经过薄层分离后，样品斑点中心距原点9.0cm，标准品斑点中心距离原点7.5cm，展开剂前沿距原点15cm，试求样品及标准品的Rf值和Rr值？ 解：

  34. (一）吸附剂 硅胶：硅胶H、硅胶G、硅胶HF254 氧化铝：可分为中性（pH7.5)、碱性（pH9.0）和酸（pH4.0） （二）展开剂 按极性由弱到强： 石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水 二、吸附剂与展开剂 Rf值在0.2-0.8 Rf值都较小,靠近原点,可增大展开剂的极性 Rf值都较大,靠近溶剂前沿,可减小展开剂的极性

  35. 展开剂的选择： 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性 （三）吸附剂与展开剂的选择 吸附剂的选择： 根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂 酸性物质：甲酸、醋酸、磷酸和草酸 碱性物质：二乙胺、氨水和吡啶

  36. 定性分析——18cm×6cm 制备纯品——20cm×20cm 硅胶G——自含粘合剂 硅胶H——不含粘合剂，铺板时另加入CMC-Na 硅胶GF254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光 四、操作方法 （一）薄层板的制备 硬板制备方法： 1.倾注法 2.括平法 3.涂铺器法

  37. （二）活化 105℃活化1h,置于干燥器中备用。 （三）点样：用毛细管或微量注射器，0.5-1mm 点样位置距薄层底边1.5-2cm处 （四）展开：在密闭的色谱缸中进行 展开操作时应注意的事项： 1.色谱缸密闭性能好。 2.注意防止边缘效应。 3.将薄板下端浸入展开剂中展开时，薄板上的点样点不 得浸入展开剂中。 4.在展开过程中注意恒温恒湿。 边缘效应是指同一物质的斑点在同一薄板上出现的两边缘部分的Rf值大于中间部分的Rf值的现象。 展开之前，先将展开剂预饱和15min或在展开装置的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸。

  38. 前沿 1 2 3 原点 • • • 2.0cm 1.5-2.0cm 展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应，浸入展开剂深度0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。 1 , 2样品 3 标准品

  39. （五）显色方法： 1.具有荧光的物质及少数紫外吸收的物质在紫外灯(254、365nm)检测 2.具有紫外吸收的物质采用荧光薄层板检测 3.显色剂显色 通用型显色剂：硫酸、碘 专用型显色剂：茚三酮用于氨基酸的显色 三氯化铁-铁氰化钾用于含酚羟基化合物的显色

  40. 四、定性和定量分析 定性分析——利用Rf值，与对照品的Rf值比较，同时在 一块薄层板上进行。也可采用相对比移值定性。 定量分析——斑点洗脱测量法，目视比较法，薄层扫描法

  41. 薄层扫描法 薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。 检测方法 吸收测定法和荧光测定法 测量方法 投射法和反射法 扫描方式 单波长和双波长 定量方法 外标两点法定量

  42. 一、基本原理 以纸做载体的色谱法 固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数： 第四节 纸色谱法 各组分在固定相和流动相之间进行分配时，由于各 组分分配系数的不同，使各组分的迁移速率不同，使之 分离。

  43. 例3：用纸色谱分离由A、B两组分组成的混合溶液，已知它们的Rf值分别为0.45、0.63，欲使分离后两斑点中心距离不小于2cm，问滤纸最少要多长？例3：用纸色谱分离由A、B两组分组成的混合溶液，已知它们的Rf值分别为0.45、0.63，欲使分离后两斑点中心距离不小于2cm，问滤纸最少要多长？ 解：设A组分斑点到原点的距离为Xcm 滤纸最少要13cm

  44. 二、影响比移值的主要因素 1.组分性质 化合物极性大或亲水性强，组分K值大，Rf小 化合物极性小或亲脂性强，组分K值小，Rf大 2.pH 离解度越大，极性越强，引起组分K的变化 3.温度 4.纸的性质 5.展开的距离 展开距离↑， Rf ↑） 展开距离↓ ，Rf ↓）

  45. 三、实验条件的选择 1.色谱滤纸的选择 具备条件：表面洁白无污点，杂质少 有一定的机械强度 纸质均匀，边缘整齐 纸纤维松紧适宜 2.固定相的选择 极性小的物质：甲酰胺或二甲基甲酰胺、丙二醇作固定相 极性大的物质：吸附纤维上的水作固定相 纸纤维起到一个惰性载体的作用

  46. 3.展开剂的选择 含水的有机溶剂 常用的展开剂：水饱和过的正丁醇、正戊醇、酚 四、操作步骤 选纸 →点样 → 展开 →显色(定性)/洗脱(定量) 五、应用

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