大豆肽与基因的相互作用

1. 现代医学导论－2012级食品安全与营养专业求是科学班现代医学导论－2012级食品安全与营养专业求是科学班 营养基因组学模块2014-03-31 Ming Qi 祁鸣, PhD, FACMG HUGO Lecturer CAP Inspector Center for Genetic & Genomic Medicine James Watson Institute of Genomic Sciences & Medical School of Zhejiang University BGI-Shenzhen Department of Pathology and Lab. Med. University of Rochester Medical Center 大豆肽与基因的相互作用 qiming_14618@yahoo.com Office：ZJU Med School A-713

2. References • Textbook: 《营养基因组学：发现通往个性化营养的途径》第11章， Jim Kaput，Raymond L.Rodriguez. 祁鸣，朱心强等（译）：浙江大学出版社　2011

3. 食物摄入与慢性病的发病率和严重性密切相关 • 食物中的生物活性分子能够影响生理和基因的表达，从而与慢性病的发病率和严重性之间密切相关。膳食中的分子通过主要或次要的新陈代谢的改变直接或间接的影响基因的表达。 • 食物中的某些组分可以通过以下途径起作用： • 作为转录因子的配体， • 作为信号传导路径中的正性或负性的催化剂 • 作为细胞核受体的配体。

4. 多食用大豆可防癌? • 广泛的流行病学证据，即多食大豆和降低某些肿瘤的发病风险有关，如乳癌、前列腺癌及大肠癌

5. 化学预防剂（Chemopreventive agent）:一种通过阻断有害的生物反应或过程从而防止疾病发生的化学成分、药物或食物补充剂。

6. 露那辛（lunasin）的结构 Gm2S-1 Signal peptide Small subunit linker Large subunit • 一个最近从大豆2S白蛋分离出来的由43个氨基酸组成大豆多肽。其羧基末端包含一个染色体结合区域，该区域是一个细胞黏附模序(精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）)跟随着八个天冬氨酸残基组成。该染色质结合区包含10个氨基酸，呈螺旋排列，与其它染色体结合蛋白中发现的小保守序列同源。 • 也可从大麦中分离得到 21 aa 43aa 17aa 77aa lunasin Chromobinding Motif RGDDDDDDDDD

7. 露那辛（lunasin）的功能 • 在动物及哺乳动物细胞影响细胞周期的调控，有化学预防剂作用 • Cholesterol management • Inflammation reduction • Antioxidant benefits • Improved immunity • Overall cellular health

8. 露那辛影响动物及哺乳动物细胞的细胞周期调控露那辛影响动物及哺乳动物细胞的细胞周期调控 • 转染露那辛基因到哺乳动物细胞中，会导致有丝分裂停滞，随后细胞凋亡。 • 露那辛有优先结合去乙酰组蛋白H4的能力。如果露那辛的多天冬氨酸尾部被切断，它与去乙酰组蛋白H4结合就会减少，然而用RGD模序（lunasin－GRG）替换，却不会减少它与去乙酰基组蛋白H4的结合。

9. 露那辛的化学预防剂作用 • 当外源露那辛增加到纳摩尔浓度时，能显著抑制化学致癌物质DMBA诱导C3H/10T1/2S鼠胚胎成纤维细胞的转化灶形成。 • 应用能够抑制雌性致癌因子敏感鼠中皮肤肿瘤发生。 • 在组蛋白去乙酰酶抑制剂、丁酸钠存在时，用露那辛处理人类C3H/10T1/2S和MCF-7乳腺癌细胞，可以观察到在乙酰化作用的核心组蛋白H3和H4的10-95倍的减少，影响致癌作用基因的表达。 • 在E1A转染的鼠成纤维细胞NIH 3T3中，露那辛抑制成纤维细胞转化灶形成。E1A是一个病毒肿瘤蛋白，可以使Rb（成视网膜细胞瘤）肿瘤抑制因子停止活动

10. 露那辛（lunasin）对前列腺癌的治疗作用及对基因表达谱的影响露那辛（lunasin）对前列腺癌的治疗作用及对基因表达谱的影响 • 前列腺癌是美国最常见的非皮肤病类癌症，在2003年大约有220900新病例和28900死亡，是美国男性第二大死因。 • 生物芯片分析技术已经成为一种有力的检测工具，它可以同时检测到成千上万个基因在不同水平的表达变化。cDNA生物芯片可以用来分析抗癌药物对前列腺细胞株基因表达谱的影响。 • 生物芯片分析检测露那辛（lunasin）处理24小时非肿瘤基因型（RWPE-1）和肿瘤基因型（RWPE-2, 前列腺上皮细胞株）前后基因表达谱的变化。 • 暴露于2μM的露那辛（lunasin）24小时后，在 14，500个已检查的基因中，有123个基因的表达水平改变超过两倍。在这123个基因中，121个基因在RWPE-1型细胞中表达上调，只有2个基因在RWPE-2型细胞中表达上调。给予2μM露那辛（lunasin）后，没有基因在非肿瘤基因型或肿瘤基因型表皮细胞中表达下调。 • 在RWPE-1型细胞中，上调的基因包括那些控制抗瘤作用、细胞凋亡和细胞分裂的控制。

11. DNA microarrays 处理前 处理后

12. DNA microarrays

13. 露那辛上调细胞凋亡基因的表达 • THBS1：在癌症细胞的凋亡或程序性死亡中有重要作用。THBS1通过活化细胞凋亡蛋白酶细胞死亡途径、或减少来抗细胞凋亡基因bcl－2表达而诱导细胞凋亡。也有抗血管生成的能力。 • BNIP3基因：一种能够活化凋亡作用而同时抑止BCL-2活性的抗细胞凋亡功能线粒体蛋白。 还可调节与凋亡无关的类坏疽样细胞坏死，例如细胞色素C释放、细胞凋亡蛋白酶的活化和凋亡诱导因子的细胞核迁移。BNIP3通过开放线粒体通透性转换孔，导致线粒体失去功能，破坏了线粒体膜，最终导致细胞死亡。 • 低氧诱导因子1α亚基(HIF一1A)：一个基本的螺旋-环-螺旋转录因子，能调节BNIP3的表达。BNIP3启动子包含一个功能性的 HIF-1A反应元件，缺氧或者HIF-1A的强迫性表达都能被激活。 HIF-1A可以与抑癌基因p53结合和稳固。 • PRKCL2，也称为PRK2，通过抑止致癌基因Akt的抗凋亡活性来促进凋亡。Akt通过磷酸化一种可以诱导凋亡的BCL-2家族蛋白BAD，减弱其活性，来实现它的抗凋亡效应。然而，于凋亡早期产生的PRKCL2 C端片断结合Akt，导致了对Akt介导的磷酸化BAD的抑制，从而使凋亡得以发生。

14. 露那辛上调细胞凋亡基因的表达 Stabilization of tumor suppressor –p53 HIF1a APOPTOSIS CASPASES PATHWAY BNIP3 THBS1 BCL-2 suppresses pro-apoptosis genes BAD stimulates pro-apoptosis genes BCL-2 BAD angiogenesis PRKCL2 Akt oncogene

15. 露那辛（lunasin）上调抑制细胞增殖基因的表达露那辛（lunasin）上调抑制细胞增殖基因的表达 • PRKAR1A基因： 该基因编码环腺苷酸依赖的蛋白激酶A型I-α的调节亚基, 一个肿瘤抑制因子。PRKAR1A的突变会引起Carney 综合征（CNC），Carney 综合征是一种常伴有甲状腺肿瘤的多肿瘤综合症。PRKAR1A突变细胞下调了基因表达的控制，导致环腺苷酸信号通路的活化以及不正常的生长增殖。 • BTB(POZ)： 该基因包含功能域1（ABTB1或者BPOZ），是肿瘤抑制基因PTEN生长－抑制信号通路中的介质之一。PTEN基因的失活在人类癌症包括前列腺癌中是很常见的。过表达BPOZ可抑制细胞周期进程和癌症细胞的生长，而转染BPOZ基因反义链则可以加速细胞的生长。 • TOB（也被指作Tob1）：Tob是抗增殖BTG/Tob家族中的一员， Tob缺陷小鼠易于自发生成肿瘤。 • ERBIN ：可与erbb2基因相互作用的蛋白，是新型的Ras信号抑制剂。ERBIN是一个富含亮氨酸的蛋白质，它与Ras相互影响，又可干扰Ras与Raf之间的相互作用， 导致Ras介导活化的细胞外信号调控激酶（Erk）负调节。

16. 露那辛（lunasin）上调抑制细胞增殖基因的表达露那辛（lunasin）上调抑制细胞增殖基因的表达 ERK RAF RAS TOB1 CellGrowth ERBIN CyclicAMP SignalPathway BPOZ PTENtumorsuppressionpathway PRKAR1A

17. 有丝分裂关卡(mitotic checkpoint) • 也称纺锤体关卡(spindle checkpoint)，是监控细胞有丝分裂期纺锤体形态与位置、着丝点与来自纺锤体微管连接状况、染色体位置和排列的监控机制；在有丝分裂关卡的监控下，只有当所有染色体都与来自纺锤体两极的微管连接并排列于赤道板上时，细胞才由有丝分裂期中期向后期转换，走出有丝分裂期。

18. 露那辛上调有丝分裂关卡(Mitoticcheckpoint)基因的表达露那辛上调有丝分裂关卡(Mitoticcheckpoint)基因的表达 • TTK蛋白激酶：酵母MPS1的一个同族体，磷酸化MAD1p,是有活化丝分裂关卡的必要步骤。酵母细胞纺锤体组装关卡早期需要MPS1 。它是活化有丝分裂关卡过程中限制性的一步，因为当过表达MPS1时，细胞分裂的途径就被激活了。过表达MPS1可以延迟细胞周期进程进入分裂后期，破坏纺锤体形。MPS1也是用于纺锤体极体复制过程中的一个重要物质。 • BUB1B（BubR1）：BubR1是关卡控制所需的蛋白激酶。通过显微注射特定的抗体使BubR1失活能够破坏细胞分裂关卡的控制。某些乳腺癌细胞株中内源性的BubR1蛋白水平下降。乳腺癌特异基因1（BCSG1）编码的致癌蛋白可直接与BubR1交互作用，导致BubR1经由蛋白酶体部件降解，使乳腺癌发生，这个过程至少部分是由BubR1失活改变有丝分裂关卡造成的。 • MAD2L1（有丝分裂阻滞缺陷二型蛋白1）：人乳腺癌细胞株中另一个关卡基因MAD2L1表达减弱，表现为染色体不稳定且易形成非整倍体。一些乳癌细胞株携带MAD2L1基因位点突变，形成一种截短蛋白产物。 提高了分子监控能力，阻止细胞过早分裂、染色体不稳定和形成非整倍体。

19. 露那辛（lunasin）上调蛋白降解相关基因的表达露那辛（lunasin）上调蛋白降解相关基因的表达 • 蛋白酶体26S亚体ATP酶6（PSMC6） • E3泛素连接酶（SMURF2） • 泛素特异性蛋白水解酶（USP1） • 泛素活化酶E1C（UBE1C） 露那辛（lunasin）上调这些基因，从而调节蛋白的降解，这些蛋白在细胞的转化和转化灶形成的起始阶段是需要的。

20. 露那辛（lunasin）上调间隙连接蛋白的表达 • 细胞间隙连接通讯（gap junction intercellular communication, GJC）: 邻近细胞之间通过允许小分子通道的间隙连接通路交流信息，间隙连接通路是由叫做连接蛋白的蛋白质组成的。 • GJC 在许多癌症细胞中被阻断，例如人类恶性前列腺癌细胞。 • 连接蛋白43（connexin43): 此蛋白已显示出有抑制肿瘤的作用。 • 在多个前列腺肿瘤细胞株中都发现了连接蛋白43表达减少及转录后修饰受损，表明阻断间隙通讯是人类前列腺癌进程的关键性一步。 • 病毒致癌基因Src通过将连接蛋白43的酪氨酸残基增加一个磷酸基团，阻断间隙连接通讯，从而使细胞生长失控。 • 转染功能性连接蛋白43基因到肿瘤性小鼠细胞后可以修复GJC、正常生长调节、细胞与细胞之间的信息交流以及对肿瘤的抑制。

21. q-PCR技术验证芯片结果 • 在mRNA水平上，使用实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）验证基因芯片分析所发现露那辛上调的4个基因，即凝血酶敏感蛋白1（THBS 1）、cAMP依赖性蛋白激酶调节亚单位类型α1(PRKARlA)、ERBB2传导器1(TOBl)和低氧诱导因子1α亚基(HIF一1A)。选择这4个基因是因为它们代表了细胞凋亡和增殖途径中的基因。 • RT-PCR对这些选定基因的分析结果与生物芯片数据（数据没有展示）的结果是一致的。

22. 其它抗癌活性物的大豆化合物 • Bowman-Birk抑制剂(BBI) 和BBIC（一种富含BBI的大豆浓缩物） : 一种源于大豆的丝氨酸蛋白酶抑制剂，无论在体内还是体外系统中都显示具有抗癌活性。可以抑制前列腺癌细胞株的生长、入侵和克隆存活。 • 染料木黄铜：大豆中主要的异黄酮, 另一个从大豆中提取的化学性预防活性物质。在体内和体外都可以抑制癌症基因，还可以抑制核转运因子NF-κB和Akt信号通路的活性，这二者都可用来维持细胞生存和凋亡之间的平衡。染料木黄铜通过上调BAX来诱导凋亡，BAX是一种对抗Bcl－2抗凋亡功能的蛋白质。用染料木黄铜处理过的PC3前列腺癌细胞，通过生物芯片分析发现它的基因表达谱有774个基因表达下调，有58个基因表达上调。与露那辛（lunasin）的效果相似，染料木黄铜改变的主要是细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、细胞信号转导、血管生成、肿瘤细胞入侵和转移中的基因表达。

23. 其它具有防治癌症作用的小多肽 Gm2S-1 Signal peptide Small subunit linker Large subunit • 21－26个氨基酸的多肽，这些多肽对血管内皮细胞具有选择性毒性，而且对小鼠具有抗癌活性。 • 露那辛和这些多肽有两个惊人的结构相似: • 细胞结合区段（RGD或者NGR） • 促凋亡区段则有一个短的螺旋状片段。 21 aa 43aa 17aa 77aa lunasin Chromobinding Motif RGDDDDDDDDD

24. 仍需进一步研究的几个问题 • 露那辛化学预防作用特征的确切机制是什么？ • 露那辛是单独起效，还是与细胞中的其它蛋白质联合作用来上调基因的表达？ • 露那辛在哺乳动物细胞中结构是否改变（比如磷酸化）？这些结构的改变对于化学预防作用是必需的么？ • 为什么露那辛对前列腺癌细胞无效？ • 在人类基因中，是否有基因的变异（例如SNPs）可以影响露那辛与细胞中其它化合物的相互作用？