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聚合酶链反应

聚合酶链反应. —— PCR 技术. 1 相 关 背 景. 又称无细胞克隆系统 。 1985 年 Kary Mullis 及同事创立，随后借助于热稳定性 Taq 脱氧核糖核酸聚合酶的发现（ 1976 年 Chien ），使 PCR 自动化成为可能； 1987 年 Kary Mullis 等完成了自动化操作装置，使 PCR 技术进行实用阶段。 1993 年度， Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。. Cycle 1. 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . Cycle 2. 5 . 5 .

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聚合酶链反应

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  1. 聚合酶链反应 ——PCR技术

  2. 1 相 关 背 景 又称无细胞克隆系统。1985年Kary Mullis及同事创立，随后借助于热稳定性Taq脱氧核糖核酸聚合酶的发现（1976年Chien），使PCR自动化成为可能； 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。 1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。

  3. Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Cycle 2 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理 Template DNA Primer 1 5 5 5 Primer 2 5

  4. 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 指数反应，25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 Cycle 3

  5. after 25 cycles, amplification = 225 ~ 1 x 106 fold after 45 cycles, amplification = 245 ~ 3.5 x 1012 fold

  6. 1、PCR的特点 • 特异性强 • 敏感性高 • 快速、简便 • 可扩增RNA或cDNA • 对起始材料要求低 • 具有一定程度的单核苷酸错误掺入

  7. PCR基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。待拷贝的 DNA 称为模板，它可以是双链 DNA 也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。 • 引物是 DNA 复制的先锋，引导 DNA 的合成。在 PCR 扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。 • DNA聚合酶是 DNA 复制的动力，在 dNTP等底物和引物指导下沿着模板 DNA 合成互补的 DNA 链。

  8. 首先将模板 DNA 置于 94℃，进行变性（denaturation）处理，使 dsDNA 在高温下解链成为 ssDNA ，且热变性不改变其化学性质； • 然后退火（annealing），将温度降至 37℃ -72℃，使引物与模板的互补区相结合； • 最后，在 72℃ 条件下， DNA 聚合酶将 dNTP 连续加到引物的 3’-OH 端，合成 DNA ，这个步骤称为延伸（extension）。 • 这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段。

  9. PCR缺点 • 扩增DNA的长度一般不超过2kb • 一定的错配率 • 容易受外源DNA的污染 • 不能全自动化

  10. 2、标准的PCR反应体系 • 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200uM/L引物 10～100pM模板脱氧核糖核酸 0.1～2ug Taq脱氧核糖核酸聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mM/L加双蒸水至 100ul

  11. 3、PCR反应五要素 • 引物（软件设计） • Taq酶 （脱氧核糖核酸 polymerase） • dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） • 模板 • Mg2+

  12. 引物 • 引物是PCR特异性反应的关键 • PCR 产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度 • 人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。

  13. 引物在反应中的浓度要一致。如果引物浓度较大，在PCR产物检测时，在溴酚兰前面可以看到1条引物带；如果引物太少，使得非特异性扩增发生，从而出现杂带。不同试验对引物浓度的要求也不一样。引物在反应中的浓度要一致。如果引物浓度较大，在PCR产物检测时，在溴酚兰前面可以看到1条引物带；如果引物太少，使得非特异性扩增发生，从而出现杂带。不同试验对引物浓度的要求也不一样。 • 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

  14. 引物设计的原则（一） ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃），不能保证PCR扩增产物的特异性 ②引物扩增跨度：以2kb为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 • G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 • ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列

  15. 引物设计的原则（二） ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处

  16. 引物设计的原则（三） ⑦引物的特异性： • 引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的DNA有高度互补，才能使用。 ⑧引物量： • 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好 • 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会

  17. 简并引物的设计 • 选择在进化过程中可能保守的区域及不被内含子间隔的区域 • 选择简并密码子少的氨基酸序列 • 选择目标物种偏好的密码子而非稀有密码子

  18. Taq酶 • 目前有两种 Taq脱氧核糖核酸聚合酶供应 • 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 • 基因工程酶：大肠杆菌合成 • 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时） • 浓度过高可引起杂带、特异产物带不清晰等结果，浓度过低则得不到所需产物。最可靠的做法是先做浓度对照，再根据结果决定最佳条件。

  19. 在100μL反应体系中，一般加入2-4U的酶量。不同公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或25μl），一般酶的用量不小于1U，否则反应效率将降低。在100μL反应体系中，一般加入2-4U的酶量。不同公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或25μl），一般酶的用量不小于1U，否则反应效率将降低。

  20. dNTP 的质量与浓度 • 在PCR反应体系中，dNTP浓度过高会抑制Taq 酶的活性，易产生错误掺入； • 使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，但不能低于10～15μM，浓度过低将降低反应产物的产量； • PCR反应体系中dNTP的终浓度为0.2ｍＭ(指每种碱基的浓度)。

  21. dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTP应为50～200 uM，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

  22. 模板（靶基因，目标因子） 模板的种类：单、双链脱氧核糖核酸或RNA都可以作为PCR的样品。 若起始材料是RNA，须先通过反转录得到第一条cDNA。 用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。 当使用高分子量的脱氧核糖核酸（如基因组脱氧核糖核酸）做模板时，如果用适当的稀有限制酶进行消化再作为模板，扩增效果会更好。

  23. 对于模板的用量来说，虽然PCR仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的脱氧核糖核酸，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的脱氧核糖核酸。对于模板的用量来说，虽然PCR仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的脱氧核糖核酸，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的脱氧核糖核酸。 而模板稀释的倍数太大也得不到产物，最好做浓度梯度对照从而确定最佳模板浓度的条件。

  24. 反应缓冲液 • 一般随Taq脱氧核糖核酸聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。 • 在72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2，恰好是Taq酶的最适pH。 • Mg离子浓度至关重要。

  25. Mg2+浓度 • 在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 • Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，就会出现红彤彤一片涂布； • Mg2+浓度过低会降低 Taq酶活性，使反应产物减少，偶尔也会在产物区出现小涂布。如果在几个其它成份对照组中都出现一样的涂布，则肯定是由于镁离子引起。

  26. 若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度脱氧核糖核酸及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度脱氧核糖核酸及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。 • 二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。 • Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳。 • 由于TE可以络合一部分镁离子，所以在用TE替代灭菌双蒸稀释引物和模板时，添加的镁离子量要稍微高一些。

  27. 4. PCR反应程序 • （1）常规程序94℃ 预变性 5min 94℃ 变性 30s-1min 37-72 ℃ 退火 30s-1min 72 ℃ 延伸 1-5min 72 ℃ 延伸10min 4℃ 保存

  28. （2）复性（退火）和延伸温度：复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间。 • 具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。延伸温度一般设定为 72℃ 。 • 如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR。

  29. （3）反应时间：变性步骤一般使用 30 到45秒，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 • 复性时间一般有 30 秒是足够的。 • 延伸时间由扩增产物的大小决定，一般获得 1kb 目的片段用 1 分钟来保证充足的时间。

  30. （4）循环次数：通常为 25～30 次，主要与模板的起始数量有关。 • 平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现产物积累按减弱的指数速率增长的现象。 • 原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

  31. PCR反应曲线

  32. （5）PCR 反应液的配制：常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入 Taq聚合酶，最后在反应液上覆盖一层石蜡油，防止水分蒸发。 • 按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热起动（hot start）PCR操作方式可较好解决这一问题。 • 将 模板、dNTP 、缓冲液， Mg2+ 和 引物 先配制好，然后加入一粒蜡珠，加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入 DNA 聚合酶。只有当 PCR 反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。

  33. [注意] 1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行 2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

  34. 5 PCR反应条件的选择 • PCR反应条件: • 温度 • 时间 • 循环次数

  35. 温度与时间的设置： • 设置变性-退火-延伸三个温度点 • 标准反应中采用三温度点法，双链脱氧核糖核酸在94℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至72℃，在Taq脱氧核糖核酸聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 • 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸

  36. ① 变性温度与时间： • 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 • 一般94℃ 30—45S足以使模板脱氧核糖核酸变性 • 若低于94℃则需延长时间 • 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 • 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败

  37. ② 退火(复性)温度与时间： • 退火温度是影响PCR特异性的重要因素 • 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 • 可根据引物结构来确定其退火温度，但它只是对引物本身而言，并不一定是该试验的最佳条件, 适当调整。

  38. 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： • Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） • 复性温度=Tm值－（5～10℃） • 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 • 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合

  39. ③ 延伸温度与时间： • Taq脱氧核糖核酸聚合酶的生物学活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子70℃ 60核苷酸/S/酶分子55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，脱氧核糖核酸合成几乎不能进行

  40. ③ 延伸温度与时间： • 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 • 常用温度为72℃ • 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 • 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 • 1Kb以内的脱氧核糖核酸片段，延伸时间1min（足够） • 3～4kb的靶序列需3～4min • 扩增10Kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些

  41. 循环次数 • 循环次数 • 决定PCR扩增程度 • 循环次数 • 主要取决于模板脱氧核糖核酸的浓度 • 循环次数：选在25～35次之间 • 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多

  42. 5 注 意 事 项 • PCR应该在一个没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的PCR实验空间。 • 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。 • 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 • PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。 • 试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 • 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 • PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

  43. 对 照 试 验 • 阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 • 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

  44. 阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。 • ②试剂对照:在PCR反应混合物中不加模板脱氧核糖核酸或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染（其能控制贮存试剂可能出现的污染或加样器被脱氧核糖核酸模板的气溶胶污染而致在吸取试剂时模板脱氧核糖核酸的混入）。

  45. 6 防 止 污 染 的 方 法 • (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的脱氧核糖核酸或RNA。 • (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

  46. (三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 • (四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性使用。 • (五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

  47. (六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。 • (七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。

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