1 / 4

Probensammlung

Probensammlung. PROBEN. URINE. GEWEBE (TURBT/CE). Urinsediment (Vergrößerung...). V73. Urinzytologie (Begutachtung durch A.Twelker-Baldauf). In flüssigem Stickstoff aus OP holen, dann wegfrieren. V30/31. V60. Vorbereitung für RNA-Extraktion. V73. Kryoschnitte. RNA-Isolation

jamese
Download Presentation

Probensammlung

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Probensammlung PROBEN URINE GEWEBE (TURBT/CE) Urinsediment (Vergrößerung...) V73 Urinzytologie (Begutachtung durch A.Twelker-Baldauf) In flüssigem Stickstoff aus OP holen, dann wegfrieren V30/31 V60 Vorbereitung für RNA-Extraktion V73 Kryoschnitte RNA-Isolation mittels Invisorb HE-Färbung (Begutachtung TZG durch Pathologin M.Toma) V17 RNA-Isolation mittels Invisorb V59 V13 Bestimmung RNA-Gehalt am Agilent Je nach RNA-Konz. Vx= 500ng/cAgilent a) > 50ng->ml-Menge mit 500ng ausrechen und A.d. bis zu 10µl ergänzen b) < 50ng + <39µl: Vx abpipettieren, Einengen in Speed Vac+in 10µl A.d.lösen500ng c)<50ng + >39µl: komplett einrotieren+in A.d.lösen39-fache Ausgangskonz. V62 cDNA-Synthese mittels Superscript RNAse H Reverse Transcriptase (blind->anfängliche Messung am Agilent->immer „nichts drin“gewesen, weil Konz.zu niedrig) V58 cDNA-Synthese mittels Superscript RNAse H Reverse Transcriptase LC-PCR Referenzgen(e) cDNA 1:2 verdünnt; NWG= 20mol (unverdünnt) V58 V45 LC-PCR Referenzgen(e)+BCa-Marker cDNA 1:5 verdünnt; NWG= 50 mol (unverdünnt) V45 LC-PCR BCa-Marker Agarosegelelektrophorese (Kontrolle Doppelbanden) Agarosegelelektrophorese (Kontrolle, ob Doppelbanden) V42 V42

  2. Etablierung neuer Gene (UCA1/CK20) BLOCK-PCR Gradienten-PCR? Fragmentlänge UCA1: 95bp; CK20490bp: 78bp Agarosegelelektrophorese 1 Bande an gewünschter Stelle? V42 Richtiges (sauberes) Fragment Großansatz Block-PCR Agarosegelelektrophorese V42 Bande ausschneiden Gelelution mit Fa.Amersham V43 Konzentrationsbestimmung am Photometer Evtl.am Agilent für genauere Konzentrationsbestimmung bei geringen Konz. V32 Ligation von DNA-Fragment (Insert) in Vektor (bei Amplifikation m.Taq-Polymerase: Poly-A-Schwanz schon am Fragment vorhanden) V34 KLONIERUNG Transformation mittels Elektroporation Transformation mittels Hitzeschock V36 V35

  3. Ausstreichen auf LB-Platten Inkubation bei 37°C über Nacht (ÜN) Einbau des Fragments in Vektor in LAC-Z-Gen o.gar kein Plasmid enthalten  keine Umwandlung X-GAL Kein Einbau des Fragments in Vektor  Umwandlung X-GAL Blue-White-Screening Blaue Bakterienkolonie Weiße Bakterienkolonien Klone picken (ca.2-4) Jeweils 1 Einzelkolonie in 2ml LB-Medium+Antibiotika (Verhinderung Wachstum anderer Kolonien) Agarplatte mit restlichen Kolonien verbleibt bis zum Ende der Klonierung (mit Plastikfolie abgedeckt) im Kühlschrank  Nachpicken jederzeit möglich Inkubation ÜN bei 37°C in Schütteltruhe bei 300rpm Plasmid-Minipräparation von allen gepickten Klonen V37 Nachzucht Klon mit gewünschtem Fragment (0,5ml) Kontrollverdau mit NotI bzw.EcoRI (1,5ml) V41 Agarosegelelektrophorese mit Verdau-Ansatz+unverdauten Ansatz V42 Falls Menge des Plasmidpräp nicht ausreichend 0,5ml Baktriensuspension+2 0der 4ml LB-Medium  Inkubation ÜN (auf diese Art immer wieder mgl.Klone „hochzuzüchten“) 2 Banden im verdauten Ansatz (Vektor+Fragment) Sequenzierung durch GATC (mind.1-2 Klone mit gewünschtem Fragment; 30µl Plasmid-DNA (100ng/µl) GVO(genet.veränderter Organismus) von allen Klonen, die laut Sequenzierung gewünschtes Fragment enthalten (ca.2)

  4. Quantitative PCR m.Light Cycler Beschichtung LightCycler-Kapillaren (Roboscreen) Quantitative PCR m.Light Cycler

More Related