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《 基 因 工 程 》. 王雅英 厦门医学高等专科学校 wangyaying@vip.sina.com. 参考网站：. http://www.dxy.cn/cms 丁香园 http://www.ebiotrade.com 生物通 www.bioon.com 生物谷 www.biooo.com 中国生物论坛 www.biosino.org 中国生物信息网 www.chgb.org.cn 国家人类基因组北方研究中心 www.dnalc.org 冷泉港实验室. 参考书目：.
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《基 因 工 程》 王雅英 厦门医学高等专科学校 wangyaying@vip.sina.com
参考网站： • http://www.dxy.cn/cms丁香园 • http://www.ebiotrade.com生物通 • www.bioon.com生物谷 • www.biooo.com中国生物论坛 • www.biosino.org中国生物信息网 • www.chgb.org.cn国家人类基因组北方研究中心 • www.dnalc.org冷泉港实验室
参考书目： • 1 .《基因工程》(21世纪高等院校教材) 楼士林 科学出版社 2001年版 • 2.《植物生物技术》(21世纪高等院校教材) 张献龙 科学出版社 2009年1月 • 3. 精编分子生物学实验指南 ( 美 )F. 奥斯伯等著颜子颖， 王海林译 北京 科学出版社 19984.《生物制药技术》，夏焕章 熊宗贵高教出版社，2005
模块一 基因工程基础知识 • 遗传学基础（DNA分子结构与功能） • 基因工程概念 • 基因工程主要操作内容 • 基因工程技术路线 • 发展历程及其意义 • 基因工程安全措施
模块二 基因工程应用知识 • 植物基因工程 • 动物基因工程 • 医药基因工程
模块三 基因工程理论知识 • 目的基因的克隆和分离 • 基因工程工具酶 • 基因克隆的载体 • 基因工程受体 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达与产物分离纯化
模块四 基因工程技术模块 • PCR 扩增分离目的基因及其电泳检测 • PCR产物清洁及其电泳检测 • 大肠杆菌感受态的制备 • 载体与目的基因的连接与转化 • 重组质粒的挑选与菌落PCR快速鉴定 • 重组质粒的抽提与质粒大小鉴定 • 重组质粒的PCR和双酶切鉴定 • 重组工程菌甘油种的制备 • 目的蛋白的诱导表达与SDS-PAGE检测
模块五 基因工程技能模块 • 如何获得大量高活性的胰岛素？ • 包括DNA和质料的提取、PCR引物设计、目的基因的PCR扩增、工具酶的选择与应用、目的基因与载体连接与检测、感受态细菌的制备、重组DNA的转化、诱导表达产物的检测
课程介绍 • 生物制药---应用生物技术制造、生产药品 • 生物技术工程---基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化工程。核心？ • 基因工程制药---免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类 • 基因工程药物的用途---癌症、心血管和内分泌疾病。
生物药物 • 生物药物是泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物及生物体的某一组成部分或整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。例如，从动、植物中提取生化药物，利用微生物发酵或动植物细胞组织培养，转化生产的药物。而现代生物技术药物，主要包括用于预防疾病的疫苗、疫情检测和临床诊断的试剂、治疗疾病的药物等。作者认为生物技术药物也属于生物药物。产品涉及了抗生素制剂，生化药品，生物制品，基因工程药物，天然药和保健食品。
基因工程药物的用途 • 许多疾病诊断、预防和治疗中有着重要价值的人源生理活性物质，如激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子等人体活性多肽，由于材料来源困难或制造技术问题而无法生产。基因工程可直接使用来源于人的基因生产药物，不仅可以大量生产各种生理活性的蛋白质和多肽药物，还可以进一步深入研究它们的生理、生化和结构，通过对基因进行改造，利用基因工程可以生产性能更加优良的药物。例如“特宝生物”生产的细胞因子（干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素）
基因工程药物的生产 • 基因工程药物的生产主要包括：目的基因的发现、分离，将目的基因插入适当的载体，转入新的宿主菌，构建工程菌，并使目的基因在工程菌内进行复制和高效表达，建立、优化基因工程菌的培养和表达目的产物的分离纯化方法，完善和确定基因工程药物的制备工艺。工业生产过程主要包括工程菌的大量培养和目的基因表达产物的分离纯化，然后，将获得的目的产物，经适当配制，制成药物。
基因工程研究 涉及 DNA 水平的操作，本门课程就是要讲述这相关的原理，如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等，讲述研究方法和技术的设计原理.
课程目的 掌握 • 基因结构、性质和基因操作步骤 • 基因工程操作中基本的应用原理 • 自主设计通用操作方法和策略 熟悉 • 影响基因操作的因素和操作中的注意事项 • 基因工程应用，尤其是基因工程在医药领域的应用现状和发展前景
1 基因、基因工程的基本概念 2 基因工程理论依据 3 基因工程研究的基本线路 4 基因工程研究发展史 5 基因工程成就 第一章 概述 第一节 基因工程概述
1 基因与基因工程 基因 是遗传信息的基本单位。基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。 4个碱基组成64个三联密码子，其中3个是终止子，61个三联密码子对应20种氨基酸。
基因工程 所谓基因工程就是应用人工方法把生物的遗传物质（DNA）分离出来，按照人们的意愿及严密的设计，将遗传物质进行体外切割、拼接和重组，然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品质；或者使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（蛋白质）的技术
2、基因工程的理论依据 （1）不同基因具有相同的物质基础： 除病毒外，所有基因都是具有遗传功能的特定核甘酸序列的DNA片段，并且所有生物的DNA组成和基本结构都是一致的 （2）基因是可以切割的： 基因呈直线排列在DNA链上，除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列（内含子）
目的基因的获取 目的基因与载体的重组 重组DNA分子导入受体细胞 具目的基因受体细胞的筛选 3 基因工程的基本技术路线
目的基因的获取 目的基因——基因工程中所要转移的基因。 获取方法：从某种生物生物体细胞中分离 通过人工合成
目的基因与载体的重组 基因一般都无法直接进入另一种生物的受体细胞，要与载体结合，只有依靠载体的运载和保护，目的基因才能进入受体细胞。 质粒就是基因工程中常用的载体。 质粒使用时要先用限制酶将其切开，再让目的基因与质粒进行体外重组。
重组DNA分子导入受体细胞 重组DNA分子——带有目的基因的质粒 重组DNA分子导入受体细胞的过程——转化 转化的目的——使目的基因所蕴含的遗传信息能在活的受体细胞那得到表达 转化成功的关键——正确选择受体细胞
具目的基因受体细胞的筛选 将重组DNA分子导入受体细胞的转化率很低，因此，应事先选择带有某种抗药性基因作为标志基因 例如，某基因工程中选用的载体带有四环素抗性基因，所选用的受体细胞是大肠杆菌
②分离获得目的基因 ③制备载体 ④ DNA重组 ⑤导入受体细胞 ⑥克隆子的筛选 ⑦克隆子的鉴定 重组DNA技术的一般步骤 ①从细胞中分离出DNA
4、基因工程的迅速发展 1980年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠 1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物―转基因烟草 基因药物：已上市的有50种左右，上百种药物正在进行临床试验
转基因植物： 1986年首次批准转基因烟草进行田间试验 1994年，转基因番茄被批准商品化生产，成为第一个上市的转基因产品 至2000年，共批准10313例转基因作物进入田间试验 据统计，转基因至少在120种植物中获得成功，涉及性状包括抗虫、抗病毒、抗细茵、抗真菌、抗除草剂、抗逆境、品质改良，以及提高产量潜力等 转基因作物种植面积持续增加，至2005，已达9000万公顷，种植转基因作物的国家达到21个
我们国家： 已经有6种转基因植物被批准进入商品化生产，包括我国自己培育的耐储存番茄（1997）、抗虫棉（1997）、观赏植物矮牵牛（1997）、抗病毒甜椒（1998）、抗病毒番茄（1998），以及美国孟三都公司培育的抗虫棉（1997）。 在上述转基因作物中，种植面积最大的是抗虫棉，到2000年底止，国产抗虫棉累计推广面积达37万公顷，减少农药用量80％，创造效益7.7亿元人民币
转基因动物： 已获得转生长激素基因鱼、转生长激素基因猪和抗猪瘟病转基因猪等 采用动物乳腺生物反应器技术生产的抗胰蛋白酶因子、C蛋白、凝血酶Ⅲ、葡萄糖苷酶和乳转铁蛋白等产品也已陆续上市，年产值约10亿美元 1995年开始大量投资开发体细胞克隆技术，研发重点是生产干细胞，用于组织修补等治疗性目的 我国在转基因鱼研究上处于国际领先地位，已生产出生产性能优良的转基因鱼。同时已较好地建立了动物乳腺生物反应器和体细胞克隆技术平台
20世纪八九十年代：基因工程基础研究趋向成熟，应用研究初露锋芒20世纪八九十年代：基因工程基础研究趋向成熟，应用研究初露锋芒 21世纪：将是基因工程应用研究的鼎盛时期，农、林、牧、渔、医的很多产品上都会打上基因工程的标记
专家希望用基因重组的生物技术培育出一朵蓝玫瑰专家希望用基因重组的生物技术培育出一朵蓝玫瑰 5.基因工程成就 1）创造新品种 2）医药生产 用转基因的大肠杆菌或猪生产胰岛素、生长激素、干扰素及多种疫苗和免疫球蛋白 能生产人促红细胞生成素的转基因牛 3）基因治疗
农 • 抗虫、病棉花 • 抗病小麦 • 抗虫水稻 • 耐贮藏番茄 • 抗除草剂作物
医药 • 医：病毒性疾病、肿瘤、风湿性疾病 • 遗传疾病 • 药：激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子（干扰素、白细胞介素、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子）
近年来，肿瘤治疗领域成为制药和生物技术公司关注的焦点之一。2009年，在ClinicalTrials.gov网站上登记的约16,000只进入Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ期临床的药物中，抗肿瘤药物约占40%。
尽管抗肿瘤靶向药物获得了成功，但是肿瘤细胞的高变异性意味着高复发率，从而带动了后续治疗药物的研发。 Evaluate Pharma公司的一份报告显示，到2016年，抗体药物将产生316亿美元的销售额，年增长率将保持在8%。
抗肿瘤靶向药物研发线上包括100～200只新型小分子药物和单克隆抗体。其中一些药物针对创新靶标，诸如热休克蛋白90、MET和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；还有一些针对现有靶标，如人表皮生长因子受体2。
抗肿瘤药物也成为近几年中国药物领域增长最为迅速的细分领域，这一潜力巨大的市场已经引起了国内外药企的极大兴趣。 WHO最近发布的数据显示，中国已经成为世界第二大癌症高发国，中国每年新增220万名癌症患者，约占全球癌症病人总数的20%。
转基因食品展望 转基因作为一项新兴的生物技术，无论哪个国家都不会在转基因食品领域退缩，因为它是解决农业和粮食问题的最终出路，被誉为“绿色农业”和“分子农业”，将给人类带来越来越多的实惠（eg.金水稻—胡萝卜素—Vit A）。 科技部部长许冠华院士：转基因食品在美国市场上已出现5年，受到普遍欢迎，再过5—10年，将充斥整个市场。根据科技部、农业部的规划，中国将加大转基因食品的研究开发和商品化应用。可以预见，转基因食品在中国市场上将会越来越多。
发展趋向 • （一）基因操作技术日新月异，不断完善，特别是基因转移技术，基因扩增技术，基因克隆技术、基因修饰技术等，并通过商业渠道，出售专项技术全套试剂，大力推广。例如临床医生采用基因扩增技术诊断疑难病症。 • （二）生物治疗突飞猛进。新型药物和疫苗已有约20多种新产品投放市场，已产生巨大的经济和社会效益，本世纪将面临医药工业的更新。 • （三）转基因植物和动物有重大突破。抗虫、抗病毒的蔬菜等农作物，抗虫的棉花，已经进入实用化阶段，本世纪初，就可以推广社会上可接受的抗虫、抗病毒的农作物。培育耐盐碱、耐干旱的农作物，在本世纪就能实现。采用新生物技术改造整个农业，估计要到2030年才能全面开展。
（四）人体基因组图谱成为国际间协作的一项大科学研究课题，对开发新药提供了美好前景。（四）人体基因组图谱成为国际间协作的一项大科学研究课题，对开发新药提供了美好前景。 （五）基因治疗出于意料地取得重大进展。1990年治疗一例先天性免疫缺陷症，现在基因治疗的对象已很快扩展到治疗恶性肿瘤、艾滋病、乙型肝炎、心血管等严重疾病。将来，恶性肿瘤、艾滋病等严重疾病的防治可望有所突破。
转基因动植物 转基因植物例如，抗花叶病毒的烟草，抗棉铃虫的棉花，抗虫的蔬菜，抗腐烂的西红柿等。 转基因动物例如，快速生长的鱼，奶汁中分泌有大量有效药物的羊或其他动物等。
农用基因工程微生物例如，改造联合固氮或共生固氮的工程菌以提高固氮能力，带有毒蛋白基因的工程菌用作杀虫剂等。农用基因工程微生物例如，改造联合固氮或共生固氮的工程菌以提高固氮能力，带有毒蛋白基因的工程菌用作杀虫剂等。 兽用基因工程疫苗采用重组DNA技术，研制兽用疫苗用于严重传染病的预防。 牛胚胎工程为快速繁殖良种牛，进行胚胎分割，异体发育。
生物治疗 • 就是采用DNA重组技术或其他新生物技术进行疾病的预防和治疗，根据目前进展，广义的生物治疗应包括重组蛋白质药物和重组DNA药物两大类： • 1、重组蛋白质药物：包括细胞素治疗，抗细胞素治疗，免疫保护治疗，导向毒素，基于基因转录因子的药物，单克隆抗体治疗制剂，疫苗治疗等方面。 • 2、重组DNA药物：包括寡核苷酸药物、基因治疗、基因疫苗等。
第二节 基因工程安全性 • 转基因技术的安全性问题 • 基因一旦被改动，一方面可能引起生物体内一系列未知的结构与功能的变化；另一方面，转基因操作对生物体的影响会通过遗传传递。
外源基因引入后，是否会影响其他重要的调节基因，甚至会激活原癌基因？ 转基因技术广泛应用是否会导致难以消灭的新病原物出现？ 是否会造成生态学灾难？ 人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？ 安全问题
