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实验五 禽流感的血清学诊断 （血凝与血凝抑制试验）

实验五 禽流感的血清学诊断 （血凝与血凝抑制试验）. 实验课内容. 禽流感概述. 1. 病原分离. 2. 实验原理. 3. 器材与试剂. 4. 病原分离. 5. 接种鸡胚. 6. HA-HI. 7. 流行病学. 禽流感病毒（ AIV） 感染禽后可引起各种综合征，从无临诊症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100%的严重全身性疾病。 迄今为止， 高致病性 AIV 都是 H5 和 H7 血清亚型 ，而所有其它亚型毒株对禽类均为低致病性（ MP）。

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实验五 禽流感的血清学诊断 （血凝与血凝抑制试验）

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Presentation Transcript

  1. 实验五禽流感的血清学诊断（血凝与血凝抑制试验）实验五禽流感的血清学诊断（血凝与血凝抑制试验）

  2. 实验课内容 禽流感概述 1 病原分离 2 实验原理 3 器材与试剂 4 病原分离 5 接种鸡胚 6 HA-HI 7

  3. 流行病学 • 禽流感病毒（AIV）感染禽后可引起各种综合征，从无临诊症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100%的严重全身性疾病。 • 迄今为止，高致病性AIV都是H5和H7血清亚型，而所有其它亚型毒株对禽类均为低致病性（MP）。 • 病禽和带毒禽是主要传染源。鸭、鹅等和野生水禽在本病传播中起重要作用，候鸟也可能起一定作用。感染途径为呼吸道和消化道。本病虽无明显季节性，但常常以冬春季多发。

  4. 临床症状 ▶低致病性禽流感（MPAI） MPAI病毒在野禽中大多数不产生临诊症状。 鸡和火鸡的表现为呼吸、消化、泌尿和繁殖器官的异常。 ▶高致病性禽流感（HPAI） 急性败血性，呼吸困难、腹泻、高热、神经症状。 发病率和死亡率很高（50～90%），有的鸡群可达100%。

  5. 病理变化 • 因宿主种类和免疫状态、病毒致病性等不同而有很大差异。 • ▶ MPAI • 病理变化主要在呼吸道，尤其是窦的损害，以卡他、纤维性、脓性或纤维脓性炎症为特征。 • ▶ HPAI • 在内脏器官和皮肤有各种水肿、出血和坏死，最急性型可能无大体病理变化。

  6. 实验原理 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

  7. 目的与要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。

  8. 器材与试剂 • 96孔“V”形微量反应板,100 uL加样器，枪头。 • 2. 生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，禽流感病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），禽流感阳性血清，被检鸡血清。

  9. 病毒分离 在感染初期或发病急性期从死禽或活禽采取。 死禽采集气管、肺、肝、肾、脾、泄殖腔等组织样品。组织样品先用肉汤培养基或PBS制成10~20（W/V）的悬液，1000 r离心10 min，取上清液作为试验样品。为防止细菌污染，应加入以下抗生素：青霉素2 000 μg，链霉素2000g，卡那霉素1000 g（每毫升培养液中所含）。样品离心后也可用细菌过滤器过滤除菌。

  10. 病毒分离 活禽用大小不等的灭菌棉拭子涂擦喉头、气管或泄殖腔，然后将带有分泌物的棉拭子放入每毫升含有1000 μg青霉、2000 μg链霉素pH7.2~7.6的肉汤中，无肉汤时可用Hanks液或25%~50%的甘油盐水。小珍禽用拭子取样易造成损伤可取而代之以采集新鲜粪便。 将棉拭子充分捻动、拧干后除去拭子，样品液经1000 r离心10 min，取上清液作为接种材料。

  11. 接种鸡胚 常用9～10日龄的鸡胚，每份病料至少注入5个鸡胚，接种于绒毛尿囊膜或尿囊内，操作方法如下。 1．照蛋，划出气室位置，在鸡胚胎面观看胚胎活动，选择无大血管处标一记号。 2．在气室顶部和标记处用碘酊和酒精消毒，并各钻一小孔。 3．用较干的碘酊棉球涂布小孔。

  12. 接种鸡胚 4．用1毫升注射器吸取上述处理过的材料，插入小孔内约3mm，缓缓注入0.1～0.2毫升，拔出针头。 5．用融化石腊封口，在蛋壳上标明日期。 6．置37℃温箱培养，每天照蛋二次，至全部或大部分鸡胚发生死亡为止（24小时内死亡的胚弃之）。 7．将死胚收藏于4℃冰箱内，气室向上，6～24小时获尿囊液。

  13. 血凝（HA）试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 μL生理盐水。 2. 于左侧第1孔加50 μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50 μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50 μL；第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50 μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。

  14. 血凝（HA）试验 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价 弃去50μL

  15. 血凝（HA）试验 4.结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（#），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。例如表中，该禽流感病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。

  16. 血凝抑制（HI）试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50 uL生理盐水。 3. 第1孔加被检鸡血清50 uL，吹吸混合均匀，吸50 uL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50 uL，稀释度分别为：1:2、1:4、1:8 …… ；第12孔加禽流感阳性血清50 uL，作为血清对照。

  17. 血凝抑制（HI）试验 4. 自第1孔至12孔各加50 uL 4个血凝单位的禽流感病毒液，其中第11孔为4单位禽流感病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50 uL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果。

  18. 血凝抑制（HI）试验

  19. 血凝抑制（HI）试验 6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（#），而 血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。 以100%抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知禽流感阳性血清抑制血凝者，该病毒为禽流感病毒。 例如表中血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。 判定标准：HI效价小于或等于3lg2判定HI试验阴性；HI效价等于4lg2为可疑，需重复试验；HI效价大于或等于5lg2为阳性

  20. 农业部2007年发文 • 禽流感灭活疫苗免疫效果判断：HI抗体效价≥ 4log2(1:16) 为免疫合格。 • 禽流感弱毒疫苗免疫效果判断：鸡群免疫抗体转阳率≥50%判定合格。 • 正常合格为从高浓度到低浓度（从前到后）红细胞沉积依次减少，如1-4孔出现不完全沉积，即凝集现象，即无抗体或抗体水平较低，不合格；反之，5-10孔出现沉淀，则抗体水平较高，合格。

  21. 思考题： 1．HA和HI试验的基本原理是什么？ 2．如何判定HA和HI试验的结果？ 3．临床上HI和HA试验各自的作用是什么？

  22. THE END~

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