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微生物发酵床养猪垫料 发酵程度判别体系的研究

微生物发酵床养猪垫料 发酵程度判别体系的研究. 研 究 生：宋泽琼 专 业：生物化学与分子生物学 指导老师：刘 波 博士、研究员 蓝江林 博士、副研究员 林 娟 博士、教授. 福州大学生物科学与工程学院 福建省农业科学院农业生物资源研究所. 主 要 内 容. 一. 研究背景和总体思路. 二. 微生物发酵床垫料的主要理化特性. 三. 发酵床垫料的微生物生物量的特性. 四. 发酵床垫料微生物群落脂肪酸的特性. 五. 发酵床垫料的挥发性物质的特性. 六. 发酵床垫料发酵程度判别模型的建立和验证. 七.

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微生物发酵床养猪垫料 发酵程度判别体系的研究

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  1. 微生物发酵床养猪垫料 发酵程度判别体系的研究 研 究 生：宋泽琼 专 业：生物化学与分子生物学 指导老师：刘 波 博士、研究员 蓝江林 博士、副研究员 林 娟 博士、教授 福州大学生物科学与工程学院 福建省农业科学院农业生物资源研究所

  2. 主 要 内 容 一 研究背景和总体思路 二 微生物发酵床垫料的主要理化特性 三 发酵床垫料的微生物生物量的特性 四 发酵床垫料微生物群落脂肪酸的特性 五 发酵床垫料的挥发性物质的特性 六 发酵床垫料发酵程度判别模型的建立和验证 七 总结与展望

  3. 一、研究背景和总体思路 微生物发酵床养猪技术 将微生物技术、发酵技术及养殖技术相结合。 优点：解决粪污处理问题， 改善猪只生长环境， 提高饲料的利用率， 增强机体免疫力， 节约资源，提高效益。

  4. 养猪微生物发酵床垫料的作用 一、研究背景和总体思路-发酵床垫料 保温隔热 畜舍无臭味 吸收粪尿水分 药物减少使用 降解粪污 料肉比降低 动物福利改善 经济效益明显

  5. 一、研究背景和总体思路-发酵床垫料 基本原理 菌种采集 垫料制作 发酵床制备 益生菌的使用 湿度约50%，较高的pH， 低的尿素、氨气和亚硝酸盐 发酵条件 技术流程 发酵床垫料 旧垫料的营养素、传导率、Cu、Zn的含量更高 营养元素分解 发酵床的氨气、N2O、NO气体的挥发 气味控制

  6. 一、研究背景和总体思路-创新点 根据物理评价指标粗略观察判断 养猪微生物发酵床的发酵程度水平 微生物群落结构 理化性状参数 养猪微生物发酵床的发酵程度水平 挥发性气味物质 微生物特性 指导微生物发酵床的日常管理 为发酵床垫料循环利用模式的建立提供实验依据

  7. 养猪微生物发酵床不同使用时间的垫料 微生物生物量 群落脂肪酸 理化性状 含量和种类 分布的特征 生产指导 一、研究背景和总体思路-技术路线 挥发性物质 环境条件、离子浓度 持水力、肥力值 微生物生物量碳 微生物生物量氮 判别模型验证 构建发酵程度判别模型

  8. 一、研究背景和总体思路-材料与方法 供试材料 使用时间： 5个月、7个月、9个月、16个月。 采集地点： 福州新店73121部队养猪场。 采集方法： “三点采样法”，共30个样品。

  9. 二、发酵床垫料的主要理化特性 1、影响微生物生长的发酵床的环境条件 • pH值：适宜的是中性微偏碱性，在相同的使用时间内各猪栏差异不显著。 • 含水量：适宜的为50%左右，使用5个月与其他三个月有显著性差异。 pH值 含水量

  10. 二、发酵床垫料的主要理化特性 2、发酵床垫料的离子浓度 电导率 盐度 • 盐度：在0.35-0.95g/L之间，如果发酵床运行出问题，必然会造成可溶性盐分大量的积累。 • 电导率：在2.3-6.6mS/cm之间，能间接推测出垫料浸提液中的离子总浓度。

  11. 二、发酵床垫料的主要理化特性 3、发酵床垫料的持水力 • 吸水性：在0.6-0.95之间，垫料吸水性不断下降，但均处于适宜状态。 • 悬浮率：在0.2%-27%之间，新垫料的悬浮率比旧垫料的变化大，发酵程度越高的垫料悬浮率越小。 吸水性 悬浮率

  12. 全磷 全钾 全氮 有机质 二、发酵床垫料的主要理化特性 4、发酵床垫料的肥力测定

  13. 使用5个月 使用7个月 使用9个月 使用16个月 三、发酵床垫料的微生物生物量特性 1、不同使用时间垫料的紫外吸光度 • 经氯仿熏蒸后，垫料中可被0.5mol/L K2SO4溶液浸提的碳含量增加，从而吸光值增大，不同使用时间的垫料其变化幅度有明显差异。

  14. 三、发酵床垫料的微生物生物量特性 2、不同使用时间垫料的微生物量（MB） • 微生物量用单位样品中的吸光度增量ΔUV280nm（△×10-3/g）表示， 公式ΔUV280nm =（abs熏/G熏）一（abs未熏/G未熏） • 不同使用时间垫料的吸光度增量呈现先下降到使用9个月之后再上升的趋势。

  15. 三、发酵床垫料的微生物生物量特性 3、不同使用时间垫料的微生物量碳、氮（MBC、MBN） MBN MBC • MBC= (6570 ± 695)×ΔUV280nm+(10.8 ± 0.9)×TC，在2160-4320 mg/kg之间，说明垫料有机质的变化会影响MBC的变化。 • MBN= (1113 ± 115)×ΔUV280nm+(27.1 ± 2.1)×TN，在125-270mg/kg之间，变化不明显。

  16. 四、发酵床垫料的微生物群落脂肪酸 1、发酵床垫料PLFA的提取 PLFA的释放和甲酯化 中和pH 萃取 转移 气相检测 PLFA提取

  17. 四、发酵床垫料的微生物群落脂肪酸 2、发酵床垫料群落脂肪酸生物标记总量和种类 • 总量：先上升后下降，使用9个月的最大，5个月的最少。 • 种类：均达60种以上，使用7个月的最多，16个月的最少。

  18. < 5000 < 5000 5000-50000 四、发酵床垫料的微生物群落脂肪酸 3、不同使用时间发酵床垫料PLFA的数量分布 表1 使用5个月垫料的部分脂肪酸生物标记在猪栏的分布 注：在脂肪酸中，i、a、сy和Me分别表示异、反异、环丙基和甲基分枝脂肪酸；ω、с和t分别表示脂肪酸端、顺式空间构造和反式空间构造。

  19. 50000-500000 50000-500000 5000-50000 四、发酵床垫料的微生物群落脂肪酸 3、不同使用时间发酵床垫料PLFA的数量分布 脂肪酸生物标记的PLFA数量在5000-50000之间的种类最多，达45种。

  20. 四、发酵床垫料的微生物群落脂肪酸 3、不同使用时间发酵床垫料PFLA数量分布 • 使用7、9、16个月的发酵床垫料的生物标记规律与5个月的相似； • 累积百分含量最高的： 16:0 指示革兰氏阴性细菌； 18:1 ω9c 指示真菌； 18:1 ω7c 指示假单胞杆菌。 种类比较 PLFA的累积百分含量>8% PLFA的累积百分含量<8%

  21. 四、发酵床垫料的微生物群落脂肪酸 4、不同使用时间发酵床垫料PFLA的分布特征 • 40种已知指示菌株的生物标记聚为三类。 • 共有89个，其中55个在不同使用时间均存在，有些标记仅在某个使用时间存在，显示出垫料微生物群落结构的变化。 聚类分析 λ=56.15 一类 小 非线性映射分析 二类 中等 三类 大

  22. 五、发酵床垫料的挥发性物质特性 1、发酵床垫料的挥发性物质的收集和分析 气相色谱-质谱检测 物质收集 SPME萃取头的老化 进样 数据库分析 Aglient 7890 GC-MS谱图 挥发性物质收集

  23. 烷类12种 五、发酵床垫料的挥发性物质特性 2、发酵床垫料的挥发性物质的分布特征 表2 微生物发酵床垫料挥发性物质特性 （匹配度≥80%，相对含量≥4%） 烯类5种

  24. 五、发酵床垫料的挥发性物质特性 2、发酵床垫料的挥发性物质的分布特征 续表2 微生物发酵床垫料挥发性物质特性 （匹配度≥80%，相对含量≥4%） 烯类5种 酯类12种 苯类2种 酚类2种 哌啶类 噻吩类

  25. 五、发酵床垫料的挥发性物质特性 3、不同使用时间发酵床垫料的挥发性物质的分布 表3 使用5个月垫料的挥发性物质特性（匹配度≥80%，相对含量≥4%）

  26. 五、发酵床垫料的挥发性物质特性 3、不同使用时间发酵床垫料的挥发性物质的分布 表4 不同使用时间的挥发性物质的分布 平均含量 平均含量 • 二丁基羟基甲苯在四个使用时间都存在，平均含量达30%以上。 • 其余的挥发性物质的平均含量在16%以下。

  27. 五、发酵床垫料的挥发性物质特性 4、不同使用时间发酵床垫料挥发性物质的分布特征 λ=6.16 聚类分析 类别Ⅰ 9个月 非线性映射分析 类别Ⅱ 5个月 类别Ⅲ 16个月 • 均存在的：正二十烷和二丁基羟基甲苯。 • 有些物质只在一定使用时间的垫料检测到：如4,5-二环己基-2,7-环己烷、十八烯、正十六烷、碘代十六烷、长叶烯、哌啶类等。 类别Ⅳ 两个时间

  28. 六、垫料发酵程度判别模型的建立和验证 1、发酵床垫料的理化性状、微生物生物量间的相关性 • 在0.05和0.01水平下，pH值和吸水性之间无相关性。 • 其他指标间两两相关，说明这些理化性状和微生物生物量间具有密切的关系，共同指示着发酵床垫料发酵程度的变化。

  29. 六、垫料发酵程度判别模型的建立和验证 2、发酵床垫料的理化性状、微生物生物量间的主成分分析 表6 各指标总的变异特性 表5 每个指标的描述统计量和公因子方差比 各指标的主成分图 各因子正交旋转后的空间载荷图

  30. 六、垫料发酵程度判别模型的建立和验证 3、发酵床垫料的发酵程度判别模型的建立 表7 拟合模型的拟合优度情况 表8 拟合模型的方差分析 拟合模型残差的直方图 • 线性回归模型方程： Y=7.232+3.395X1-0.018X2-0.001X3，R2=0.688； • 其中Y表示发酵床垫料的发酵程度级别，X1、 X2和X3分别表示全氮、微生物生物量氮、微生物生物量碳。

  31. 六、垫料发酵程度判别模型的建立和验证 4、发酵床垫料的发酵程度判别模型的验证 模型判别准确率达83.3%，精确度可以满足垫料发酵程度归类。

  32. 发酵床垫料的pH值、电导率、含水量、盐度、全磷、全钾呈升高的趋势，吸水性、悬浮率、有机质、全氮和微生物生物量碳含量逐渐下降；微生物生物量氮含量的变化规律不明显。发酵床垫料的pH值、电导率、含水量、盐度、全磷、全钾呈升高的趋势，吸水性、悬浮率、有机质、全氮和微生物生物量碳含量逐渐下降；微生物生物量氮含量的变化规律不明显。 • 检测到89种脂肪酸生物标记，累积百分含量最高的三个脂肪酸生物标记是16:0、18:1 ω9c、和18:1 ω7c。 • 检测到7类27种挥发性物质，包括烷类、烯类、酯类、苯类、酚类、哌啶类和噻吩类。分布普遍的有二丁基羟基甲苯和烷类物质。 • 垫料的发酵程度判别模型为： Y=7.232+3.395X1-0.018X2-0.001X3，R2=0.688。判别模型的准确率达83.3%，精确度可以满足微生物发酵床垫料发酵程度的归类。 七、总结与展望 总结

  33. 展望 七、总结与展望 今后的研究方向可以有以下两点： • 采集使用一年半以上的发酵床垫料来检验本论文中建立的发酵床的发酵程度判别模型。 • 测定全国乃至国外的发酵床垫料的发酵程度判别指标，进一步修订本论文中发酵程度的判别模型，使其能更广泛使用。

  34. 致 谢 • 衷心感谢本论文的指导老师——刘波研究员、蓝江林博士和林娟教授，在整个研究生阶段给予我很多鼓励和帮助。没有你们的悉心指导，就没有这篇论文的顺利完成！ • 衷心感谢福建省农业科学院农业生物资源研究所的所有工作人员和同学！ • 衷心感谢学院的领导、老师和我认识的所有同学，因为有你们的相伴，我的研究生生活变得充实而又快乐！

  35. 谢 谢 ！ 请多提意见

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