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第六章 精子冷冻储存

第六章 精子冷冻储存. 刘勇. 引言. 从 19 世纪 40 年代未起人类就开始研究精子低温生物学。随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目 由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案。冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶以提高细胞的存活率. 引言.

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第六章 精子冷冻储存

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  1. 第六章 精子冷冻储存 刘勇

  2. 引言 • 从19世纪40年代未起人类就开始研究精子低温生物学。随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮存技术取得快速发展，在许多国家建立起商业用途的精子库和国际间合作服务项目 • 由于采用不同的冷冻保护剂和不同冷冻程序，出现许多冷冻贮存实验设计方案。冻融后细胞存活率主要取决于细胞内冰晶形成量能降低至何种程度，通过选择恰当的冷冻保护剂和采用最适冷冻速率和复融速率来减少细胞内水形成冰晶以提高细胞的存活率

  3. 引言 人类精子能够耐受一定范围内的冷冻和复融变化。它们对快速冷冻（冷体克）产生的损伤不敏感，主要原因可能是精子细胞膜中脂质双分子层结构的不饱和脂肪酸增加了细胞膜的流动性 因为细胞内水分含量少（约为50%），精子比其他细胞更能耐受低温导致的损伤。但是低温仍能对精子功能产生不良影响，特别是对精子活力影响比较大 一般而言，只有大约50%的活动精子能在冻存后复苏保持活力

  4. 引言 影响供精人工授精的妊娠率的因素包括复融后精子质量、人工授精的时机，而最为关键的是受方因素如年龄，前次供精妊娠情况以及与排卵、子宫输卵管相关的疾病 如果精子保存方法合适，精子质量不会随着冻存时间的延长而下降，有报道冷冻保存超过28年的精子仍能使妇女受孕分娩婴儿 精子冷冻适可适用于很多情况，在某些特殊情况下，冻存过程需要进行一些更改，比如稀少精子冷冻

  5. 适应症 供精：不孕不育症夫妇 生育力保存 阻断传染性疾病的传播 人类精子冷冻和贮存是一个很复杂的过程，实验室工作人员不仅需要有高度的责任感，而且需要对综合风险进行评估

  6. 风险评估 材料安全 人员安全 交叉感染 样本安全

  7. 在65ml的无菌蒸馏水中加入1.5g葡萄糖和1.3g二水三羧酸柠檬酸钠在65ml的无菌蒸馏水中加入1.5g葡萄糖和1.3g二水三羧酸柠檬酸钠 混入15ml的甘油 加入1.3g的甘氨酸，完全溶解后用0.45µm的细孔过滤器过滤 加入20ml的新鲜蛋黄（从特制的无菌蛋中提取）：洗净鸡蛋把蛋壳剥去，用注射器穿刺鸡蛋膜取到蛋黄，一般一个鸡蛋取10ml的蛋黄 在56℃水浴箱中孵育40分钟，并且要时不时搅拌一下 检测溶液中的pH值，如果pH值超出6.8-7.2之间范围，这样的溶液是不理想的,应该丢弃重新制备，因为可能加错试剂或试剂量 在此阶段，细菌培养进行无菌检测 冷冻保护剂配置

  8. 复苏冷冻保护剂，升温至室温并且混匀，温度到达37℃的效果最好复苏冷冻保护剂，升温至室温并且混匀，温度到达37℃的效果最好 在精液中添加冷冻保护剂需要很小心，因为高浓度的甘油会对精子有害 可以一边滴一边旋转，也可以用吸管上下混匀，或者逐渐加入5滴后在室温下搅拌5分钟，最终GEYC与精液的比例是1：2 加完GEYC后，需要在30-35℃的温箱里孵化5分钟 添加冷冻保护剂

  9. 把麦管或者冷冻管放到程序冷冻仪中，并按照操用说明激活程序把麦管或者冷冻管放到程序冷冻仪中，并按照操用说明激活程序 最常用的程序是按照每分钟1.5℃的速率从20℃降到–6℃，然后以每分钟6 ℃的速度降到–100℃，整个过程大概需要40分钟。在转到液氮之前，需要在–100℃下放置30分钟 不同实验室根椐自身经验有可能会使用更复杂的方法 冷冻（程序降温法）

  10. 人工冷冻法不像程序冷冻仪那样易于控制，但也能得到良好的结果，在这个过程中有很多方法可以选择人工冷冻法不像程序冷冻仪那样易于控制，但也能得到良好的结果，在这个过程中有很多方法可以选择 麦管应先在–20℃的冰箱中放置30分钟，然后在–79℃的干冰中放30分钟。最后放入–196℃的液氮 麦管从-20℃冰箱移入另一个-70℃冰箱，或移入-80℃至-100℃的小容器颈部的有液氮蒸气和空气的混合气体的篮子内放置10-15分钟后投入液氮中，也可以通过放置在装液氮的大容器上方10-20cm悬挂支架，放置1小时形成温度梯度层。 冷冻（人工法）

  11. 在使用前，从液氮或者氮气罐中拿出需要用的麦管然后放在薄纸或者试管架上，这样在6分钟内就可以达到室温，而冷冻管需要花比较多时间在使用前，从液氮或者氮气罐中拿出需要用的麦管然后放在薄纸或者试管架上，这样在6分钟内就可以达到室温，而冷冻管需要花比较多时间 在10分钟内，用无菌剪刀把麦管尾部去掉，并放入受精设备中或吸取内容物，复苏后检测精子活动力 如果是用速冻法进行冷冻，则复苏时用快复苏法，应用小剂量多步骤稀释法把冷冻保护剂除开，这样能够避免不恰当渗透压并且能够提高妊娠率 复苏

  12. 稀少精子冷冻 只有很少的活动精子的精液以及从生殖道中取到的精子悬液可以冻存起来用于ICSI 如果有必要，可以把精液在1500g的离心力下离心10分钟，制成最小0.4ml的悬液，按照上文所述添加GEYC 附睾穿刺液、睾丸提取物或经过上游法或者密度梯度法形成的其他精子悬液，用含人血清白蛋白的精子培养液重新悬浮，这样重新悬浮后的精子液就可以加入TGG冷冻保护剂，或者用含有人血清白蛋白的冷冻保护剂。

  13. 所有涉及到精液标本的识别的步骤，包括样本接受、处理样本、麦管贴签、放入冷冻箱内、复融样本及丢弃样本都应该双人核对，并且核对过程在实验室记录中登记。而且每一位工作人员一次最好仅处理一份精液样本所有涉及到精液标本的识别的步骤，包括样本接受、处理样本、麦管贴签、放入冷冻箱内、复融样本及丢弃样本都应该双人核对，并且核对过程在实验室记录中登记。而且每一位工作人员一次最好仅处理一份精液样本

  14. 谢谢！

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