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抗体制备技术. 1 、多克隆抗体( p olyclonal a ntibody, pAb ):用 一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺激 机体多个 B 细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同 抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的 混合物~。 2 、单克隆抗体( monoclonal antibodies, mAb ):由一个识别一种抗原表位的 B 细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。. 骨髓瘤小鼠取腹水. 脾. B 细胞. 骨髓瘤细胞. 抗原. + PEG, 融合. 杂交瘤细胞. HAT 培养,稀释. Ab2.

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Presentation Transcript
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抗体制备技术

1、多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb):用

一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺激

机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同

抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的

混合物~。

2、单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb):由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。

slide2

骨髓瘤小鼠取腹水

B细胞

骨髓瘤细胞

抗原

+ PEG, 融合

杂交瘤细胞

HAT培养,稀释

Ab2

Ab2

单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图

Ab1

Ab2

Ab3

Ab4

抗血清

Ab3

Ab1

Ab4

Ab1

Ab4

Ab3

普通抗血清(多克隆抗体)

单克隆抗体

slide3
抗体制备技术
  • 一、多克隆抗体制备
  • (一)免疫原的制备
  • (二)免疫动物
  • (三)免疫血清的纯化
  • (四)免疫血清的鉴定
  • (五)免疫血清的
  • 二、单克隆抗体制备
  • (一)单克隆抗体制备原理
slide4
抗体制备技术
  • (二)单克隆抗体制备的技术要点
  • (三)影响杂交瘤技术的因素
  • (四)单克隆抗体的应用
  • 三、基因工程抗体技术
  • (一)人源化抗体
  • (二)小分子抗体
  • (三)双特异性抗体
  • (四)抗体库技术
slide5
一、多克隆抗体制备

(一)免疫原的制备

免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系

统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最

重要的性质是免疫原性(immunogenicity)

免疫原—天然抗原、人工或合成抗原;

蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原;

具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗

原性抗原和免疫佐剂~

slide6
1、细胞性抗原制备:

绵羊红细胞(SRBC)- 溶血素;

细菌- 抗菌抗体(动物免疫血清)

2、可溶性抗原制备:

指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化~

  • 1)细胞的破碎(物理法、化学法)
slide7
2)提取与纯化:

①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点,通过差速或梯度密度离心,将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法,只适宜少数大分子物质的分离。

②选择性沉淀—选择某抗原理化特性,采用相应沉淀剂或溶液环境~例50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋;8%~12%PEG

6000可沉淀IgG~。

slide9
③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛~③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛~

④层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等,用于抗原等物质的精提~

⑤电泳——(略)

3)鉴定:

鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、

纯度以及免疫学活性。

slide12
3)鉴定:

鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、

纯度以及免疫学活性。

  • 蛋白的含量—定氮(紫外光280nm等)
  • 分子的质量—电泳、质谱
  • 蛋白的纯度—电泳、高效液相层析
  • 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
slide14

100 000

75 000

50 000

1 2 3 4 5

Westernblot鉴定三株单抗的特异性

1.分子量标准;2.阴性对照:正常小鼠血清;3.纯化后的B6与病毒上清反应;4.纯化后的G12与病毒上清反应;5.纯化后的2B12与病毒上清反应。

slide15
3、半抗原性免疫原的制备

半抗原(hapten)~

蛋白质等载体(carrier)~

连接—物理法:即利用电荷和微孔吸附

半抗原

化学法:利用某些功能基团把半

抗原连接到载体分子上

slide16
4、免疫佐剂(immunoadjuvant),佐剂

指某些物质,因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体,可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。

种类—无机、生物性、人工合成、油剂和

纳米颗粒。

用途—抗原表面积增,构型改变;延长抗

原的滞留时间;增强吞噬~

slide17
(二)免疫动物

  • 1、免疫动物的选择:

①抗原来源与动物种属的关系(越近越差)

②动物个体的选择(年龄、体重与健康,)

③抗原性质与动物种类

  • 2、免疫的方法:

免疫原的剂量~

免疫的途径与其间隔时间~

免疫动物采血~

(对实验成功与否至关重要)

slide18
(三)免疫血清的纯化
  • 1、特异性抗体的纯化
  • 1)亲和层析
  • 2)吸附
  • 2、IgG类抗体的纯化
  • 1)盐析
  • 2)凝胶过滤
  • 3)离子交换
  • 4)亲和层析
slide19

在凝胶过滤柱(sephadex G-200)上血清蛋白的层析示意

(M=IgM, G=IgG, A=IgA)

slide22
(四)免疫血清的鉴定

1、抗体效价的测定(凝集、扩散、ELISA)

2、特异性的鉴定(免疫印迹、双扩散)

3、纯度的鉴定(SDS-PEAG)

4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合

的牢固程度,以亲和常数表示。

测定方法有平衡透析、ELISA、竞争(非

竞争)结合等。

slide23
单抗亲合常数的测定:
  • 单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法:
  • 1)先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和;
  • 2)以该抗原浓度为实验条件,饱和时的OD值作为OD-100,找出OD-50时的抗体浓度和相应的pp65抗原浓度;
  • 3)根据公式Ka= n-1 计算McAb的Ka值。
  • 2(n[Ab’]t-[Ab ]t)
  • t代表测定时的温度;
  • n=[Ab]t/[Ab’]t;
  • [Ab]t表示抗原浓度较高的Amax的一半;
  • [Ab’]t表示抗原浓度较低的Amax的一半。
  • 对于单克隆抗体,一般亲合力要求>107L/mol,好的单抗多大于109 L/mol。
slide24
(五)免疫血清的保存
  • 1、4℃保存(6个月)
  • 2、低温保存(-70 ℃ ~-20 ℃ ,5年)
  • 3、真空干燥保存(5 ~ 10年)

注意点:保存前需经除菌

保存液含防腐剂

避免反复冻融(分装)

slide25
二、单克隆抗体制备
  • 单克隆抗体(monoclone antibody,McAb)是由抗原致敏的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,经克隆化培养后由一个细胞克隆所分泌的只识别单一抗原决定簇的纯的抗体。
  • 其理化性状高度均一,生物活性单一,高度特异及高效价特性,用于临床实验室诊断与临床疾病治疗。
slide28
(一)单克隆抗体制备的原理
  • 利用杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 即致敏B淋巴细胞分泌特异性抗体能力与骨髓瘤细胞具无限繁殖能力,从杂交瘤中经克隆化后成为单个细胞克隆并分泌抗体,称为单克隆抗体。
  • 制备过程—致敏B淋巴细胞(免疫动物)

杂交细胞瘤制备、筛选

杂交瘤细胞分泌抗体的确认

分泌抗体的杂交瘤细胞克隆

单克隆抗体的批量生产

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(二)单克隆抗体制备的技术要点
  • 1、免疫动物选择纯系Balb/c小鼠
  • 2、骨髓瘤细胞用以融合前应经过筛选
  • 3、细胞融合
  • 4、阳性克隆的筛选
  • 5、克隆化
  • 6、单克隆抗体的制备
  • 7、单克隆抗体的纯化和鉴定
  • 8、单克隆抗体的保存
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(三)影响杂交瘤技术的因素
  • 1、试剂与器材

用前必须经严格的筛选,尤其血清、融合剂

  • 2、培养技术

防止污染,细胞培养的娴熟技能~

  • 3、早期克隆化

避免无关细胞克隆的过度生长,但又应避免

克隆细胞的丢失。

slide31
(四)单克隆抗体的应用
  • 1、医学检验诊断试剂

利用单抗具有的特质-特异性与纯度高,理化性均一~

  • 2、蛋白质的提纯

将其作为亲和层析中的重要配体~

  • 3、肿瘤的导向治疗协助示踪
slide32
三、基因工程抗体技术
  • 基因工程抗体(genetic engineering antibody)又称重组抗体,指应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行改造和装配,经导入适宜的受体细胞后重新表达的抗体。
  • 包括:(一)人源化、小分子、双价特异

及抗体融合蛋白等。

(二)抗体库技术

humanized antibody
(一)人源化抗体(humanized antibody)
  • 人源化抗体指将鼠源性单抗,通过基因克隆和DNA重组及蛋白质工程学等技术,用人源氨基酸序列取代鼠的使其保留亲本鼠单抗的亲和性与特异性,但降低鼠单抗的异源性利于人体内使用。
  • 1、嵌合抗体(chimeric antibody)
  • 2、改形抗体(reshaped antibody)
slide34
(二)小分子抗体
  • 小分子抗体指相对分子质量比较小但具有抗原结合功能的分子片段~。
  • 小分子抗体:抗原结合片段(Fab)、可变

区片段(Fv)等~

  • 优点:分子小,通透性强

原核细胞表达,成本低

不含Fc段,不与带Fc段受体反应

半衰期短,利于及时清除

slide35
(三)双特异性抗体
  • 双特异性抗体(bispecific antibody)又称双功能抗体。他具有针对两个不同抗原位点结合的特性,可同时与两种不同抗原发生结合,不同于天然抗体。
  • 1、化学交联~
  • 2、细胞工程~
  • 3、基因工程~
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(四)抗体库技术
  • 抗体库技术是指用细菌克隆代替B细胞克隆来表达制备各种抗体(抗体谱)。

噬菌体展示(phage display),即用分子克隆的方法将外源基因片段插入噬菌体壳蛋白的非必需区,该基因的表达产物与壳蛋白一起以融合蛋白的形式展示于噬菌体颗粒的表面。

slide38
(四)抗体库技术
  • 主要特点:
  • ①简单快速(无须细胞融合)
  • ②选择范围广
  • ③可模拟体内免疫系统反应
  • ④可直接获得特异性人抗体
  • ⑤规模生产方便