1 / 48

EPO 的杂质检测方法

EPO 的杂质检测方法. 2005 级生命科学基地班 张毅荣 王 薇. EPO 中的杂质检查项. 外源性 DNA CHO 细胞蛋白 牛血清白蛋白 钠离子 枸橼酸离子 细菌内毒素 异常毒性实验 可见异物检查. 一 . 外源性 DNA 残留量测定法 — 斑 点杂交法. 原理：

jace
Download Presentation

EPO 的杂质检测方法

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. EPO的杂质检测方法 2005级生命科学基地班 张毅荣 王 薇

  2. EPO中的杂质检查项 • 外源性DNA • CHO细胞蛋白 • 牛血清白蛋白 • 钠离子 • 枸橼酸离子 • 细菌内毒素 • 异常毒性实验 • 可见异物检查

  3. 一.外源性DNA残留量测定法—斑点杂交法 原理： 供试品中的外源DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA比对后，可测定供试品中外源DNA的含量。

  4. 试剂： • DNA标记和检测试剂盒 • DNA杂交膜 尼龙膜或硝酸纤维素膜 • 2%蛋白酶K溶液 称取蛋白酶K0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20 ℃备用。 • 3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白0.03g，溶于灭菌水10ml中。 • 1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用盐酸调pH值至8.0 • 5.0mol/L氯化钠溶液0. 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）. • 5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）。

  5. 20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液 用盐酸调pH至7.2。 • 蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml(pH8.0),5mol/L氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5ml, 加灭菌水至10ml。 • TE缓冲液（pH8.0) 量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2ml, 加灭菌水 至1000ml。 • 1%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA0.01g,置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于 -20 ℃备用。 • DNA稀释液 取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。

  6. 用于探针标记和阳性对照的DNA, 由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行。 探针标记和阳性对照的DNA的制备

  7. 将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每lml含 107个细胞。取悬液lml，离心，在沉淀中加裂解液400 μl混匀，37℃作用12-24小时后，加入饱和酚溶液450μl , 剧烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450 μl重复抽提一次; 转移上层液体，加入三氯甲烷450 μl，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟; 转移上层液体，加入pH5.2的3mol/L醋酸钠溶液40 μl，充分混合，再加入-20℃以下的无水乙醇1ml ,充分混合，-20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟; 用适量-20℃70%乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA, 即得。

  8. 鉴定阳性对照品的DNA纯度: 10%琼脂糖凝胶电泳法:无RNA和寡核昔酸存在; 分光光度法:A260 /A 280 比值应在1.8-2.0之间。 用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片断大小适合于DNA杂交和探针标记。 探针的标记 按试剂盒使用说明书进行。

  9. 测定法—斑点杂交法 (1)蛋白酶K预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混合后37℃保温4小时以上，以保证酶切反应完全。

  10. 注意事项: 1） Dl、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA1000ng。然后依次10倍稀释成10ng/100μl (D1)、1ng/100 μl (D2) 、100pg/100μl (D3)三个稀释度; 如成品使用剂量较大，而且 DNA限量要求（100pg/剂量）较严格时，则需要提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA对照应稀释成100pg/100μl (D1)、10pg/100 μl (D2) 、1pg/100μl (D3)三个稀释度。阴性对照为DNA稀释液。

  11. 2） 用DNA稀释液将供试品(原液)稀释至每100μl含1人份剂量。 3） 加入3%牛血清白蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质与供试品(通常为蛋白质)的酶切条件保持一致;如供试品为其他物质，则应改用其他相应物质。

  12. (2)点膜 用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照置100℃水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以每分钟8000转离心5秒，用抽滤加样器点样于杂交膜(因有蛋白质沉淀，故要视沉淀多少确定加样量，以避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照加样体积应一致，或按同样比例加样)。晾干后置80℃真空干烤1小时以上。

  13. （3）杂交及显色 按试剂盒使用说明书进行。 将膜置于预杂交液中(5* SSC, Blockingreagent 1%w/v, N-lauroylsarcosine sodium salt0.1%w/v, SDS 0. 02 % w/v) 68℃预杂交4h,置膜于含25ng/ml探针的杂交液中，68℃杂交16h。 为了降低杂交膜背景，膜片的洗涤用2*SSC,0.1%SDS室温洗2次，15min/次，后用0.1*SSC,0 .1 % SDS洗二次，每次15min，不断振摇后将膜置于l0ml Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl pH7. 5 0.15mol/L NaCI)中，静置1min，再将膜置于BufferⅡ (Buffer I加入1 % Blocking reagent)中30min，再置于含150mU/ml Anti-digoxigenin-AP conjugate的Buffer中37 ℃ 40min。待反应完毕后，用BufferI洗膜2次，15min/次，用Buffer Ⅲ (100mmo1/L Tris-HCl pH9. 5，100mmo1/L NaCI, 50mmo1/LMgCl2)平衡5min后，取l0ml BufferⅢ加人400μl显色液浸匀，将膜片置于其中，暗处显色。当斑点清晰后，用注射用水洗膜，室温晾干。

  14. 结果判定 阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定的颜色梯度，阴性对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成立。将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。

  15. 二.双抗体夹心法测杂蛋白含量 检测原理： 将已知抗体包被微量反应板和待测抗原发生特异性免疫反应，再加酶标抗体和底物，根据显色反应对抗原进行定性或定量。

  16. 1.抗BSA单抗的制备及筛选 用BSA免疫BALB/c小鼠，共3次，每次间隔2-3周。取脾，SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，检测单抗亚型。大量制备并纯化单抗。 2．抗BSA多克隆抗体的制备及标记 用BSA免疫白兔3次，每次间隔1周，采血，硫酸铵沉淀及层析纯化，蛋白定量，采用过碘酸钠一乙二醇方法标记辣根过氧化物酶(HRP)。

  17. 3. EL1SA夹心法 将定量后的单抗稀释到1:400后包被96孔酶标板，4℃包被过夜，37℃封闭1h。分别加入0-40 ng/ml浓度BSA的标准溶液，每浓度2孔，100 μl /孔。以稀释液作为空白对照。待测样品分别测定原倍和2倍稀释后浓度。37孵℃育1 h,PBST-Tween 20洗涤。加入1:12 000稀释度的酶标抗BSA多克隆抗体，100 μl /孔，室温30 min。PBST-Tween 20洗涤。加入TMB显色，100μl /孔，室温10 min。加入1 mol/LHCl终止。测定A450，以0 ng/ml标准溶液的A值消零。以BSA含量为横坐标，A值(两孔均值)为纵坐标，绘制标准曲线。应为一直线相关。

  18. 三.钠离子测定法 本法系用火焰光度法测定供试品中钠离子含量。某些含碱金属或碱土金属元素的供试品溶液用喷雾装置以气溶胶形式引入火焰光源中，靠火焰的热能将供试品元素原子化并激发出它们的特征光谱 ，通过光电检测系统测量出待测元素特征光谱的发光强度可求出供试品中待测元素的含量。通常借比较对照品溶液和供试品溶液的发光强度，求得供试品中待侧元素的含量。

  19. 测定法 精密量取供试品0.5ml,置50ml量瓶中,用水稀释至刻度，即为供试品溶液。按火焰光度法测定，在589nm波长处测定供试品溶液的发光强度。另精密称取于110℃干燥至恒重的氯化钠0.293g,置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，再精密量取该溶液0.9ml、1.1ml、1.3ml、1.5ml、1.7ml，分别置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，制成0. 9mmol/L、1. 1mmol/L、1.3mmol/L、1.5 mmol/L、1.7mmol/L的系列标准钠溶液，同法操作。 用系列标准钠溶液的浓度对其相应的发光强度作直线回归处理，将供试品溶液发光强度代入回归方程，求得供试品溶液钠离子浓度为(mmol/L),，再乘以供试品的稀释倍数(100),计算出供试品钠离子含量。

  20. 四.枸橼酸离子测定法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。 应用HPLC对样品进行分离分析，主要根据样品的性质选择分离类型及相应的色谱柱，流动相，检测器等。

  21. 色谱条件 用苯乙烯—二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色潜柱(H+)，粒度9μm或8μm, 内径7.8mm, 柱长300mm; 柱温为50℃; 流动相为0.004mol/L硫酸溶液，流速为每分钟0.8ml，示差折光检测器。

  22. 测定法 精密称取经减压干燥至恒重的枸椽酸钠0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml，分别置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀, 即得相对应的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸檬酸离子对照品溶液。分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图; 另精密量取供试品溶液1 ml,置15 ml离心管中，精密加1.5%磺基水杨酸溶液lml ,混匀。室温下以每分钟2000转离心10分钟。取上清液，同法测定。 用对照品溶液的枸橼酸离子浓度对峰面积进行直线回归，求得回归方程，计算出供试品溶液枸橼酸钠含量(mmol/L)，再乘以供试品稀释倍数，计算出供试品枸橼酸离子含量(mmol/L).

  23. 五.细菌内毒素检查法 鉴于家兔法费时较长，操作繁琐，近年来发展了体外热原试验法即鲎试验法，其原理是利用鲎(Limus polyphemus)的变形细胞溶解物(amebecyte lysate)与内毒素之间的凝集反应来检测或定量内毒素。 通过凝胶限量试验来检测由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

  24. 鲎试验检测细菌内毒素的机理

  25. 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0. 015EU/ml的灭菌注射用水。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和一与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。

  26. 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0-8.0的范围内。 对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

  27. 内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定: L=K/M 式中L，为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示; K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5EU /(kg·h)， 鞘内用注射剂K=0.2EU /(kg·h); M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml /(kg·h)、mg/(kg·h)或U /(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。

  28. 确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD: MVD=cL/λ 式中L为供试品的细菌内毒素限值; c为供试品溶液的浓度，如供试为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1,计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L; λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。

  29. 鲎试剂灵敏度复核试验 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。取分装有0. 1ml鲎试剂溶液的10* 75mm试管或复溶后的0. 1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml 不同浓度的内毒素标准溶液， 每一个内毒素浓度平行做4管; 另外2管加0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃士1℃的恒温器 中，保温60分钟士2分钟。

  30. 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度若管内形成凝胶，且不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度若管内形成凝胶，且不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

  31. 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。 λc=lg-1(∑X/4) 式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个是阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

  32. 抑制性干扰试验 适用情况： 1.进行新药的内毒素检查试验前 2.无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时 3.当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺 改变或 试验环境中发生了任何有可能影响试验结果 的变化时，须重新进行干扰试验

  33. 按下表制备溶液A、B、C和D，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。按下表制备溶液A、B、C和D，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。

  34. 按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。 Es =lg-1(∑Xs/4) Et =lg-1(∑Xt/4) Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值。 当Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。

  35. 检查法 凝胶限量试验 按下表制备溶液A,B,C和D。使用稀释倍数为最大有效稀释倍数并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 凝胶限量试验溶液的制备 注: A为供试品溶液, B为供试品阳性对照，C为阳性对照，D为阴性对照。

  36. 结果判断 保温60分钟+2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。 若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定;否则判供试品不符合规定。

  37. 六.异常毒性检查法 本法系生物制品的非特异性毒性的通用安全验检查制品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。 原理：用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其毒性反应。反应的判断以试验动物的死亡与否为终点。

  38. 检查法 ------ 小鼠试验法 除另有规定外，每批供试品用5只小鼠，注射前每只小鼠称体重，应为18-22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml,观察7天。观察期内,小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，供试品判为合格。如不符合上述要求，可用10只小鼠复试一次，判定标准同前。

  39. 七.可见异物检查法(灯检法) 可见异物是指存在于注射剂中，在规定条件下目视可以观测到的任何不溶性物质。 实验室检测时应避免引入可见异物。当复溶冻干制剂时，或盛装供试品的容器(如不透明、不规则形状容器等)不适于检测，需转移至洁净透明的适宜容器中时，均应在l00级洁净环境(如层流净化台)中进行。

  40. 图中A为带有遮光板的日光灯光源。光照度可在1000-3000lx范围内调节。用于无色溶液检查，光照度应为l000-1500lx;用于透明塑料容器或有色溶液检查，光照度应为2000-3000lx。B为不反光的黑色背景。C为不反光的白色背景和底部(供检查有色异物)。D为反光的自色背景(指遮光板内侧)。图中A为带有遮光板的日光灯光源。光照度可在1000-3000lx范围内调节。用于无色溶液检查，光照度应为l000-1500lx;用于透明塑料容器或有色溶液检查，光照度应为2000-3000lx。B为不反光的黑色背景。C为不反光的白色背景和底部(供检查有色异物)。D为反光的自色背景(指遮光板内侧)。

  41. 检查法 除另有规定外，取供试品，除去容器标签，擦净安瓶外壁污痕，放室温静置一定时间,在避光室内或暗处，手持瓶颈部于伞棚边缘处,在明视距离(指供试品至人眼的距离，通常为25cm)，分别在黑色和白色背景下,轻轻旋转和翻转容器使药液中可能存在的可见异物悬浮(注意不使药液产生气泡)，用目检视。检查时限为20秒。供试品装量每支(瓶)在10ml以下的每次检查拿取2支(瓶);10ml以上的每次检查拿取1瓶(支)。50ml或50ml以上注射液按直、横、倒三步法旋转检视。

  42. (1) 注射液 除另有规定外，取供试品20支(瓶)，照上述方法检查，检出可见异物的应不得超过1支(瓶)。如检出可见异物的有2支(瓶)，应另取20支(瓶) 同法复试，均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外来异物。 (2）注射用冻干制剂 除另有规定外，取供试品5支(瓶)。将供试品和溶解液的温度平衡至各品种规定的溶解温度，再沿瓶壁缓缓注入溶解液，旋转轻摇溶解。有真空的供试品，待供试品即将全部溶解时，破其真空，照上述方法检查; 无真空度的供试品，待供试品全部溶解后照上述方法检查，应不得检出可见异物。如检出可见异物的有1支(瓶)，应另取5支(瓶)同法复试，均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外来异物。

  43. 参考文献 1.中国药典2005年第三部 2.周铁群，陈震，强东.应用酶免疫方法检测生物制品中残余牛血清白蛋白含量.中国生物制品学杂志, 2004,17(3):171-172. 3.孟胜利.对疫苗DNA残留的检测.生物技术世界,2006,06:44-45 4.李玉，姚伟，张岩锐，王跃.地高辛标记探针检测生物制品中残余DNA含量.微生物学免疫学进展. 2002, 30(4):23-255. 5.黄冬,房判石,金燕辛.鲎试剂法检测细菌内毒素假阳性原因浅析.首都医药.2002,05:53-54 6.张新妹.细菌内毒素检查法:指导原则.中国药品标准2004,5(2):58-61

  44. 谢谢

More Related