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Opération Biopuces

Opération Biopuces. Resp : Pr. J.R. Martin Site en cours de construction Version du 15/12/2003. Axes de recherche du groupe Biopuces. Fonctionnalisation & optimisation des supports Conception & réalisation de biopuces Puces à oligonucléotides Puces à protéines

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Presentation Transcript

  1. Opération Biopuces Resp : Pr. J.R. Martin Site en cours de construction Version du 15/12/2003

  2. Axes de recherche du groupe Biopuces • Fonctionnalisation & optimisation des supports • Conception & réalisation de biopuces • Puces à oligonucléotides • Puces à protéines • Mise en oeuvre des biopuces • Nouvelles méthodologies

  3. Fonctionnalisation & optimisation des supports • Chimie de surface sur support verre ou silicium silice • Silanisation et fonctionnalisation pour : - Immobilisation des oligonucléotides - Synthèse in situ • Approche physicochimique • Approche physique

  4. Conception, fabrication & mise en œuvre de biopuces • Sélection de sondes par bioinformatique • Développement des protocoles de matériel biologique • Fabrication de puces de validation par synthèse in situ • Lecture dynamique de puces à ADN • Deux applications : • Génotypage • Expression de gènes

  5. Outils informatiques pour la conception, l’analyse et la validation expérimentale de biopuces de génotypage Conception automatisée de séquences sondes pour le génotypage sur puce Analyse d’image pour l’interprétation de biopuces de génotypage

  6. Puces à oligonucléotides (1/5) Le groupe Biopuces développe depuis 1997 des procédés de fabrication de puces à oligonucléotides par microprojection de réactifs. Deux échelles réactionnelles : 5 nanolitres, 3 picolitres Deux procédés : • Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide • Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide

  7. Puces à oligonucléotides (2/5) Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques Dispositif expérimental½ Batterie avec 128 moyens de microprojectionGrande vitesse de fabrication (50 puces/h)Absence de contamination Fabrication de puces à ADN pour le diagnostic : production de masse

  8. Optimisation de la densité de greffage des sondes / processus d ’évaporation d’une goutte projetée : nano-mouillage T ambiante : 22.5°C Humidité : 43%RH

  9. Puces à oligonucléotides (3/5) Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiquesbasse à moyenne intégration Dispositif expérimentalChimie des phosphoramiditesProjection des nucléotides (5nl) Fabrication rapide et flexible de puces en quelques exemplaires : conception de biopuces, mise au point de protocoles biologiques

  10. Puces à oligonucléotides (4/5) Synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques par la voie des phosphoramidites : adaptation du cycle de synthèse Couplage localisé par microprojection de la base et de l’activateurAutres réactions non localisées par microfluidique Réacteur anhydre et saturé en solvant

  11. Puces à oligonucléotides (5/5) :synthèse in situ haute intégration Dispositif expérimental en cours de développementChimie des phosphoramiditesProjection des nucléotides (3 picolitres)

  12. Biopuces pour la protéomique (1/2) solvant Fixation contrôlée de peptides sur support plan : • peptides synthétiques fixés par couplage covalent orienté sur support • Objectif : réalisation d’édifices dendrimériques • Applications : • Reconnaissance de protéines pour diagnostic immunologique • Programmes : • CNRS “Protéomique” ; Région RA ”Méthodologies analytiques” ; • Partenaires • Rosatech, Université Lyon I (LBASB, LBCP), EFS, Protéine’Xpert Peptides fixés Peptides non activés Validation de la chimie de couplage (fluorescence, IR) Objectif : immobilisation de dendrimères peptidiques

  13. Biopuces pour la protéomique (2/2) : Synthèse « in-situ » localisée d’oligopeptides N-alpha-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-Alanine NH2 Activateur (DCC) AA -Fmoc n Rinçage O Etape 1 Schéma de couplage Synthèse des Fmoc O n Etape 2 O Déprotection du Fmoc O Etape 4 Etape 3 Rinçage Principe: adapter le procédé de synthèse in situ de biopuces du LEOM à la chimie des Fmoc

  14. Nouvelles méthodologies • Optimisation de l’hybridation des biopuces : micromélange & microfluidique, étude cinétique des interactions cibles/sondes sur support solide • Lecture dynamique des puces à ADN • Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées • Etude du comportement de biomolécules sur support solide • Biocapteurs

  15. fluorescence Position X Etude du comportement de biomolécules sur support solide Analyse cinétique de reconnaissance entre biomolécules Détection de SNP sur support solide : discrimination de deux cibles à un nucléotide prêt

  16. Biocapteurs d’ADN Cartographie d’impédance optoélectrochimique pour la reconnaissance biomoléculaire

  17. Principaux programmes de recherche • 2003 • Outils de conception et de fabrication de biopuces pour la protéomique, Programme de Recherche Région Rhône-Alpes, Thématique Prioritaire : Sciences Analytiques Appliquées (2003/2005) • Puces ADN : étalement de gouttes avec évaporation et mécanismes réactionnels, modélisation mathématique et numérique, PIR CNRS : Microfluidique et Microsystèmes fluidiques (2003/2004) • Micro-mélangeur à advection chaotique pour une hybridation optimisée des biopuces,FITT (2003/2004) • 2002 • Puces à ADN pour le diagnostic génétique, Programme GENHOMME (2002/2004) • Conception et Validation d’une biopuce à PNA pour la traçabilité génétique des agents pathogènes, développement de l’équipement d’analyse associé, Programme MENRT (2002/2004) • Autofluorescence & système moléculaire autofluorescent pour l'étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées, ACI Nouvelles méthodologies analytiques et capteurs (2002/2004) • Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (“Multiple Antigen Peptide”), Programme CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003) • Micro-mélangeur à advection chaotique pour l’hybridation des biopuces, Bonus Qualité Recherche 2002 (2002/2003) • 2001 • Machine de production de puces à ADN 256 sondes par microdéposition, Programme ANVAR de transfert de technologie (2001/2003) • Réalisation d’une puce à ADN pour l’étude du transcriptome de Buchnera Aphidicola, Bonus Qualité Recherche 2001 (2001/2002)

  18. Principaux programmes de recherche • 2000 • Projet ROSA2 (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme Puces à ADN du CNRS (2000-2002) • 1999 • Faisabilité d'un réacteur pour la fabrication de réseaux d'oligonucléotides par synthèse chimique parallèle localisée par microdéposition, Programme CNRS MICROSYSTEMES (1999/2000) • 1997 • Projet ROSA (Réseaux d’Oligonucléotides pour le Séquençage d’ADN) du programme GENOME du CNRS (1997-2000)

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