黑龙江生物科技职业学院

1. 黑龙江生物科技职业学院 生物制药技术 生物分离技术 主讲人：张爱华

2. 实训二、制备谷光甘肽 1 目的要求 2 2 实验原理 3 材料用具 操作方法 4 5 注意事项 5

3. 目的要求 了解树脂柱纯化法制备谷光甘肽的基本原理； 熟悉树脂柱具体应用技术； 掌握多肽类生化物质提取纯化的基本操作技术。

4. 原 理 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三 肽。自然界中谷胱甘肽主要存在于酵母、谷物种子 胚芽，人体和动物的心脏、肝脏、肾、肌肉、血液 的红细胞和眼球中。动物组织中含量较高，而植物 组织中的含量较低。正常人体内还原性谷胱甘肽 （GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSHG）的比例为 100：1，还原性谷胱甘肽（GSH），分子小，是 机体内重要的活性物质，它具有清除自由基、减毒、 促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA 的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生 理功能。在医学上、食品行业及运动保健上具有广 泛的应用。

5. 原 理 制备谷胱甘肽（GSH）的方法，国内主要为酵母 菌生物合成，每克酵母菌干细胞含GSH 18mg。 所采用的分离提纯GSH的方法主要有两种，铜盐 法和离子交换树脂法。本次实训采用市售或经发 酵法制得的干酵母为原料，经加热提取，离心除 杂质，阳离子树脂交换、有机溶剂沉析等分离纯 化得GSH湿品，经真空干燥后即得GSH成品。

6. 材料用具 干酵母 100g ；732阳离子交换树脂（60～80目） 5mol／L 30mL 、1mol／L 3000mL的硫酸溶液，2mol／L、 1mol／L盐酸溶液、丙酮 、硅藻土、2mol／L氢氧化钠、 2％偏磷酸溶液、5％碘化钾溶液、淀粉指示剂、 0.001 mol／L的碘酸钾溶液。 低温冰柜、冷冻离心机、不锈钢锅、搪瓷桶、冷冻干燥 机、温度计、酸度计、层析柱、布氏漏斗、电瓷炉。

7. 提 取 将干酵母置于不锈钢锅中，在搅拌的条件下加入3倍体积的蒸馏水，再加入6倍体积沸腾的蒸馏水，升温至90～100℃，保持10 min，然后速冷至2～10℃。

8. 粗 提 液 用5mol／L硫酸调节pH值至2.8～3.0，冷冻离心（3000 r／min, 5～10℃） 15 min，收集离心液。在离心液中加0.5％硅藻土助滤，抽滤得到黄色抽提液待用。

9. 粗 提 液 层 析 抽提液上732阳离子交换树脂柱，流速6 mL／min，然后用1 mol／L硫酸洗脱，洗脱流速2 mL／min,25 min左右开始收集5mL流出液,进行快速含量测定,当流出液滴定值超过0.2 mL／mL时，开始收集，滴定值低于0.2 mL／mL时停止洗脱。

10. 粗 提 液 层 析 （1）732阳离子交换树脂装柱 将市售732阳离子交换树脂磨碎，筛选出60～80目。物理方法处理后，先以4倍树脂体积的2mol／L盐酸搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍体积的2mol／L氢氧化钠溶液搅拌浸泡2h，反复用水洗至近中性后，再用4倍树脂体积的2mol／L盐酸搅拌浸泡2h，最后水洗至中性。按要求装柱后用1 mol／L硫酸平衡备用。 （2）GSH含量快速测定（碘量法） ①取5 mL待测样品，置于250 mL锥形瓶内，加入5 mL 2％偏磷酸溶液，1 mL 5％碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.001 mol／L的碘酸钾溶液滴定至溶液由无色变为蓝色止。 ②计算滴定值（碘酸钾溶液／待测样品，mL／mL）

11. 沉 析 将洗脱液倾入搪瓷桶中，在搅拌的条件下加入溶液体积10倍的冷丙酮（2～8℃），然后静置沉淀过夜，过滤收集沉淀。

12. 干 燥 将沉淀置于真空干燥器中干燥，即得成品。

13. 注意事项 • 用硫酸调节pH值时，应用酸度计边测边调。 • 保证其准确性。 2.离子交换树脂柱层析时应根据滴定值来确定 收集洗脱液的间隔时间，随着洗脱时间的增加， 收集洗脱液的间隔时间应逐渐缩短。

14. 思考题 1．绘制出GSH标准曲线能否快速确定滴定值 的大小？如何绘制出GSH标准曲线? 2．提取时为何加热后又要速冷？