一实验目的

1. 实验四双向免疫扩散试验 一实验目的 • 学习双向免疫扩散实验原理 • 掌握双向免疫扩散实验操作方法 • 学习双向免疫扩散实验结果分析

2. 抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。 • 抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。

3. 二 实验原理 • 双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散，在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析，常用于: （1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估算。 （2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 • 双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型（见图1）

4. 图1 双向免疫琼脂扩散孔型 ○ ○ ○ ○ ○ 三孔型 双孔型 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○○ 双排孔型 梅花孔型

5. 三 试剂与器材 1.缓冲液：4.65gTris加水溶解，加115ml 0.1 M HCl，最后补水至1000ml，pH为8.2。 2.凝胶液：5g琼脂糖加500ml上述缓冲液，微波炉加热煮沸溶解。注意用中小火，以免暴沸。 3.待测样品 4.羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体、羊抗人apoA-I抗体。 5.生化培养箱、微波炉、刻度吸管、培养皿、下口径2mm滴管等

6. 四 操作步骤 1.制板：用移液管吸取热琼脂9ml，平铺于直径6cm培养皿中。 2.打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打孔，孔径2mm,孔与孔距离3-4mm。用针挑去孔内琼脂。 3.用微量加样器将羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体及羊抗人apoA-I抗体各5-10ul加入周边孔中，中间孔加不同峰的液体。 4.将培养皿置于生化培养箱内，于37℃温育，隔天观察结果。

7. 五 注意事项 1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。 2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意不要将孔弄破。

8. 六 复习题 1.双向免疫扩散的原理及应用。