植物快速繁殖专题学习 —基本技术

1. 植物快速繁殖专题学习 —基本技术 陈 刚 华南师范大学生命科学学院 2005.5

2. 基本技术 实验室设备及器材 培养基及配制 实验操作技术

3. 实验室设备及器材 常用设备 器材

4. 超净工作台

5. 紫外灯

6. 培养架

7. 灭菌锅

8. 电子天平

9. 酸度计

10. 人工气候箱

11. 培养大棚

12. 玻璃器皿 量筒、容量瓶、培养皿、广口瓶、细口瓶、培养瓶、三角瓶、玻璃棒、移液管、滴瓶等

13. 工具 解剖刀、镊子、剪刀、吸耳球、封口膜、酒精灯等

14. 培养基及配制 培养基： 培养基成分（五大类） 植物激素 配制 母液的配制 培养基配制程序 常用培养基配方 MS 、B5、N6及各自特点

15. 培养基 培养基成分大致可以分为五大类，大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、植物激素（生长调节剂）。

16. 大量元素 大量元素是指氮、磷、钾、钙、镁、硫等元素。其中氮是培养基中大量需要的。在MS培养基中，以铵态氮的含量为主。磷是生物必需的一种元素，也是作为能源aTP合成所不可缺少的，培养基中以磷酸根(P02—)的形式添加，另外钾、钙、镁、硫等元素，也是植物生长所必需的，这些元素缺乏会产生缺素症，影响酶的活性和代谢。

17. 微量元素 微量元素是植物生命活动不可缺少的。锰、铜、钼、锌等是植物生长所需要的微量元素，MS培养基中经常使用。

18. 铁盐 铁在合成叶绿素中起重要作用，是植物生长不可缺少的金属元素，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。铁盐(FeSO4和FeCl2)在 pH5.2以上常成Fe(OH)2的不溶性沉淀，所以常用以FeS04·7H20和Na2-EDTa结合成的螯合铁。

19. 有机成分 维生素是植物组织培养中经常使用的，有维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等。肌醇对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有促进作用，还可以增强愈伤组织的生长。在组织培养中，大多数情况不能正常进行光合作用，必须在培养基中加糖，作为碳源。同时糖的浓度对调节培养基的渗透压有一定作用。培养基中使用最普遍的是蔗糖，浓度为2～3％。

20. 植物激素 植物激素是植物生命活动中不可缺少的物质，它能促进细胞的分裂生长及诱导器官的分化。组织培养中应用较多的有吲哚乙酸(IAA)；吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，4—二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6—苄基氨基嘌呤(6-BA)、CPPU、TDZ等。

21. 配制 母液配制顺序是： • 用灵敏度为0.1mg的天平称取药品。 • 往烧杯加入适量蒸馏水或无菌水。 • 将药品放入烧杯内,并用玻璃棒搅拌使其溶解,难溶时可适当加温以加速溶解。 • 要待一种药品完全溶解再加入下一种药品 • 所加入的药品应依次加入，直至药品全部加入溶解为止。 • 母液装入相应的瓶内，特别是有机成分的母液应该放入4℃冰箱。

22. 培养基配制顺序 • 取烧杯或三角瓶注入一定量的蒸馏水，将各种母液按所需容积分别用移液管吸取并混合在一起，然后按要求加入一定量的激素、蔗糖后定容至一定体积。 • 用1mol/L的NaOH或HCl调节pH。 • 如制固体培养基，则加入1%左右的琼脂后加热煮沸，使其熔化。 • 分装，可用漏斗将液状培养基注入培养瓶，注入量视培养瓶容量大小而定，通常为容器的1/5左右。

23. 培养基配制顺序 • 封瓶口。 • 高压蒸汽灭菌。120℃，1.5Mpa,消毒15～20min。注意压力不能太大，时间也不宜过长，否则蔗糖、有机物特别是维生素类物质会在高温下分解，影响培养基的酸碱度，琼脂也会分解，颜色变深且不易凝固。 • 灭菌后的培养基可放入接种室内静置，让其降温后凝固，如需斜面可将其斜放。

24. 常用培养基配方

27. 特点 • MS培养基特点是无机盐浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也比较合适，也不需要附加更多的有机附加物。是目前应用最广泛的一种培养基。

28. 特点 • B5培养基特点是含有较低的铵，这个成分可能对不少培养物生长有抑制作用。从实践中得知，有些植物在B5培养基中生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。

29. 特点 • N6培养基的特点是成分简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高且不含钼。在国内已广泛用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和组织培养。

30. 实验操作技术 • 外植体的选择 • 外植体的灭菌 • 接种 • 培养 • 外植体褐化及防止 • 玻璃化及预防

31. 外植体的选择 外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。除培养基成分外，决定外植体培养成败的另一重要因素是外植体的来源。再有，不同品种、不同部位之间的分化能力都有巨大差别。

32. 外植体的选择 • 选择合适的外植体部位 不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的。在组织培养过程中，如何选择合适的、最以表达全能性的部位是决定组织培养体系成功的前提之一。

33. 外植体的选择 • 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。

34. 外植体的选择 • 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。

35. 外植体的选择 • 选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。一般进行快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，如选取茎尖，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高，携带细菌数量较少，在器官建成上也更为容易。此外，嫩叶、花蕾等携菌量较少，容易形成愈伤组织。

36. 外植体的选择 • 选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5—1.00cm之间。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。

37. 外植体的灭菌 灭菌的目的是既要杀死材料表面的全部微生物，又要不伤害材料，这要根据不同的材料，选用适当的消毒剂、合适的浓度和处理时间，灵活掌握。能够杀菌的消毒剂种类很多，但适于进行植物材料杀菌的消毒剂种类并不多。

38. 灭菌剂 使用浓度(%) 消除的难 灭菌时间(min) 效果 次氯酸钠 2 易 5～30 很好 次氯酸钙 9-10 易 5～30 很好 漂白粉 饱和浓度 易 5～30 很好 氯化汞 0.1-1 较难 2～10 最好 酒精 70～75 易 0.2～2 好 过氧化氢 10-12 最易 5～15 好 溴水 1-2 易 2～10 很好 硝酸银 1 较难 5～30 好 抗菌素 4-50mg/L 中 30～60 较好 外植体的灭菌 • 常用灭菌剂的使用及其效果

39. 外植体的灭菌 • 消毒步骤 用加有少许洗衣粉或洗洁精的水溶液洗1～2次或流水冲洗数小时"70％～75%的酒精浸蘸几秒钟并摇动"0.1％～0.2％的升汞(氯化汞，HgC12)+ 0.1％吐温中-20的消毒液中浸泡3～5(或0.1％升汞中浸泡10min) 并摇动"无菌水冲洗3～5次"准备接种。

40. 外植体的灭菌 • 注意事项 ①消毒时间 在酒精溶液中浸蘸的时间不能过长，一般不超过30秒，否则材料会严重脱水而死亡。在消毒液中消毒的时间随材料的大小、忍耐力、种类和浓度而异，最好要做预备试验来加以确定。

41. 外植体的灭菌 ②消毒液用量 消毒液用量一般应是材料体积的5～10倍以上。 ③消毒 消毒时一定要随时摇动，使材料表面尽可能全面地与消毒液接触；消毒后的材料应立即用无菌水清洗，并尽快切取所需外植体移入新鲜培养基上，减少在空气中的暴露时间，避免材料的风干和褐化。

42. 外植体的接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均需无菌操作。

43. 外植体的接种 注意事项: • 操作人员须换经灭菌的工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行灭菌，进行操作前再用70％的酒精擦洗双手。 • 操作期间经常用70％的酒精擦拭双手和台面。

44. 外植体的接种 • 在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内。解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。 • 工具用后及时灭菌，避免交叉污染。 • 工作人员的呼吸也是污染的主要途径。 • 由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。

45. 培养 接种后的外植体应送到培养室去培养。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH等。

46. 培养 • 光照 光照对离体培养物的生长发育具有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导来说，暗培养比光培养更合适。但器官的分化需要光照，并随着试管苗的生长，光照强度需要不断地加强，才能使小苗生长健壮，并促进它从“异养”向“自养”转化，以提高移植后的成活率。

47. 培养 • 温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23～32℃之间。培养室一般所用的温度是25±2℃。低于15℃或高于35℃，对生长都是不利的。模仿自然界的昼夜温差，夜间暗培养时适当地降低温度，有利于组培苗生长健壮和诱导生根。

48. 培养 • 湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100％；二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70％一80％的相对湿度。

49. 培养 • 氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。在固体培养中，最好采用通气性好的瓶盖或瓶塞。 此外，愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质的枯竭，水分的散失，以及一些组织代谢产物的积累，必须将组织及时转移到新的培养基上。

50. 外植体褐变及防止 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。