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第三章 药物杂质检查 Drug purity and its control

第三章 药物杂质检查 Drug purity and its control. 定义 : 杂质是药物中存在的无治疗作用 , 影响药物稳定性和疗效 , 或者对人体有害的物质 . ChP 将任何影响药品纯度的物质均称为杂质. 第一节 药物的杂质与限量. 一 药物纯度 (Purities of drugs) 杂质存在将影响药物纯度 , 杂质检查也叫纯度检查 , 目的是保证用药安全 , 有效 . 四十年代生产的盐酸哌替啶 ( 度冷丁 ) 只有一种结构是有效的 , 而产品中混有二种无效的异构体 , 直到 1970 年用 GC 才将三种异构体分开 .

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第三章 药物杂质检查 Drug purity and its control

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  1. 第三章 药物杂质检查Drug purity and its control • 定义: 杂质是药物中存在的无治疗作用, 影响药物稳定性和疗效, 或者对人体有害的物质. • ChP将任何影响药品纯度的物质均称为杂质

  2. 第一节 药物的杂质与限量 • 一 药物纯度(Purities of drugs) • 杂质存在将影响药物纯度, 杂质检查也叫纯度检查, 目的是保证用药安全, 有效. • 四十年代生产的盐酸哌替啶(度冷丁)只有一种结构是有效的, 而产品中混有二种无效的异构体, 直到1970年用GC才将三种异构体分开. • 早期使用的反应停是dl, 造成很多胎儿畸形, 后来通过对其不同异构体的代谢产物实验发现, R体具有安全的镇静作用, 而S体的代谢产物具有胎毒性和致畸作用.

  3. 人类对药物纯度的认识是在防治疾病的实践中积累起来，随着分离检测技术的进步，能进一步发现药物中存在的新杂质，从而加强对生产工艺过程的控制，不断提高药物的纯度。 • 例如在1848年发现阿片中的盐酸罂粟碱，1981年采用合成法进行生产. ChP1985采用目视比色法检查盐酸罂粟碱中的吗啡，后来对合成的盐酸罂粟碱中的杂质进行研究，采用TLC和IR进行分析，发现还含有一个未知的碱性物质，ChP1990将检查吗啡改为检查有关物质，检查方法为TLC；ChP2010将检查方法又改为HPLC，进一步提高了检测的专属性和灵敏度

  4. 二 杂质来源 • 来源: 生产中引入: 中间体, 付产物, 原料, 残留溶剂 • 无效, 低效晶型, 旋光异构体 • 储存中引入: 分解, 水解, 降解, 氧化等

  5. + + 例:乙酰化不完全 水杨酸(杂质)

  6. 三、药物杂质的分类 • 种类: 按来源: 一般和特殊杂质 • 按性质: 信号杂质, 有害杂质和无(低)效杂质 • 按结构: 无机, 有机, 残留溶剂. • 特殊杂质是在特定药物的生产和贮藏过程中引入的杂质，常称为有关物质(Related Substances /Compounds)

  7. 四. 杂质限量检查 • 药物的纯度是相对的，绝对纯净的药物是不存在的，考虑到:﹙1﹚工厂生产工艺及水平, ﹙2﹚人体耐受程度,﹙3﹚患者负担﹙生产成本﹚, 允许药品中有一定量的杂质存在, ∴杂质检查是限量检查, 即只需要检查杂质是否超出规定的限量. • 允许限量的前提: ﹙1﹚不影响疗效, ﹙2﹚不产生毒付作用. ——在保证药物的质量可控和使用安全的前提下, 药物中所含杂质的最大允许量叫杂质限量.

  8. 三种检查方法 标准对照法 测定法 灵敏度法 • 1.检查方法: ﹙1﹚供试品和杂质对照品在相同条件下处理并比较;﹙2﹚一定条件下于供试品中加入试剂,观察有无正反应发生, 即由反应灵敏度控制限量 ; (3)直接测定杂质的某些参数，如吸收度、pH值等. • C×V ×100% • S • 由标准对照液的浓度和体积(C,V)控制限量 L＝

  9. 1.标准比较法 例1. 葡萄糖中重金属的检查 方法： 规定：含重金属≯百万分之五(5ppm) 计算：应取标准铅溶液(10gPb/ml)多少ml？

  10. 例2. 对乙酰氨基酚中氯化物的检查 对照品溶液: 标准NaCl溶液(10gCl-/ml) 方法：取5.0ml同法操作比较, 样品管的浊度不得更大. 计算：氯化物限量是多少(% )？

  11. 2.在供试品溶液中加入试剂,在试验条件下反应,不得出现正反应. 即以检测条件下反应灵敏度控制杂质限量. 如：蒸馏水中氯化物的检查 5滴 1mL 0.2mg/50mL4µg/mL

  12. 3.取一定量供试品,在规定条件下测定待检杂质吸光度, 与规定限量比较, 盐酸溶液 样品 供试品液(2.0mg/ml) A310nm (0.05mol/L) 例：肾上腺素中酮体的检查 规定： A310nm≯0.05 L=0.06%

  13. 第二节 杂质的检查方法 • 因为药物中存在的杂质量很少，所以要选择一个灵敏度高，专属性强的方法，使药物对其所含微量杂质的检测不产生干扰 。

  14. 一、杂质的研究规范 • （一）有机杂质在药品质量标准中的名称 • 1．以杂质的化学名称作为项目名称 当被检查的杂质是已知化合物时(特定杂质)，就以该化合物的化学名称作为质量标准中的项目名称；阿司匹林中的游离水杨酸。如果杂质的化学名太长，又无通用的简称，可选用相宜的简称或习称作为项目名称，并在质量标准起草说明中写明该已知杂质的结构式；如肾上腺素中的“酮体”。如果杂质亦无相应的简称或习称，则可使用“杂质A”、“杂质B”或“杂质Ⅰ”、“杂质Ⅱ”等作为特定检查的项目名称。

  15. 2．以某类杂质的总称作为项目名称: 当杂质不能明确为单一物质而又为某一类物质时，则以这类物质的总称作为项目名称。如 “其他生物碱”，“还原糖”和“总糖”，“聚合物”，“有关物质”。 • 3．以检测方法作为项目名称: 当被检查杂质的结构未知，亦不属于具体的类别时，可用“杂质吸光度”、“溶液透光率”、“易炭化物”等，以检查方法相应的名称作为项目名称。

  16. （二）杂质检查项目的确定 • 杂质检查项目的确定要有针对性。应包括药物在质量研究和稳定性考察中检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物。应根据其起始原料、生产工艺及稳定性情况确定。除降解产物和毒性杂质外，在原料中已控制的杂质，在制剂中一般不再控制。单一对映体药物，其可能共存的其他对映体应作为杂质检查。消旋体药物，当已有其单一对映体药物的法定质量标准时，应在该消旋体药物的质量标准中设旋光度检查项目。

  17. （三）杂质限度的确定 • 杂质限量的确定要合理，在确保用药安全有效的前提下，应考虑到生产的可行性及批与批之间的正常波动，还要考虑药品本身的稳定性以及测定方法的误差。杂质限度的制订应考虑如下因素：1.杂质及含一定限量杂质的药品的毒理学研究结果；2.给药途径；3.每日剂量；4.治疗周期；5.给药人群；6.杂质药理学可能的研究结果；7.原料药的来源；

  18. （四）杂质检查方法的选择与验证 • 药物中杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及杂质的不同采用不同的检测方法。有机杂质的检测方法多采用色谱法，特别是HPLC法。 • 用于杂质检查的分析方法要求专属性好、灵敏度高。

  19. 二、杂质的常用检查方法 • （一）化学方法 • 1.显色反应检查法 当杂质与试剂产生颜色时，采用比色法控制杂质的限量，多为目视比色，例： 氯硝柳胺结构式如下： • 需检查生产原料2-氯-4-硝基苯胺和5-氯水杨酸 • 5-氯水杨酸可以与三氯化铁试液反应生成紫色配位化合物，而产品不溶解,没有现象产生。用灵敏度法进行检查：取本品0.50g，加水10ml，煮沸2分钟，放冷，滤过，滤液加三氯化铁试液数滴，不得显红色或紫色。 • 2-氯-4-硝基苯胺分子结构含有芳伯氨基，可以发生重氮化-偶合反应而呈色。

  20. 2.沉淀反应检查法 当杂质与试剂产生沉淀时，采用比浊法控制杂质的限量，也可以采用重量法测定杂质的量。 • 例： 盐酸肼屈嗪中游离肼的检查 • 方法：取本品0.10g，加水5ml与水杨醛的乙醇溶液 (1→20)0.1ml，1分钟内不得出现浑浊。 生物碱沉淀剂检查生物碱

  21. 3.生成气体的检查法 当杂质与试剂反应产生气体时，可用来控制杂质的限量。 • 如盐酸乙基吗啡中胺盐检查:OH-1/NH3. • 4.滴定法 滴定剂只与杂质反应，以一定浓度的滴定液滴定药物中的杂质，可以定量地测定杂质的含量。 • 如VitE中生育酚的检查→铈量法。

  22. （二）色谱方法 • 色谱法是有关物质检查的首选方法，特别是HPLC。 • 1．薄层色谱法 • (1)杂质对照品法：适用于杂质已知并有杂质对照品的情况. • 方法 根据杂质限量, 取供试品溶液和一定浓度的杂质对照品溶液, 分别点于同一薄层板上展开, 定位后进行检查.

  23. （2）供试品(主成分)自身对照法 高低浓度对比法 • 适用于杂质的结构不能确定或无杂质对照品的情况. • 例：氢化可的松中有关物质检查 • 供试液:3mg/ml • 对照液:60g/ml(供试液稀释50倍) • 判断:供试液的杂质斑点数≯3个, • 且供试液的杂质斑点颜色≯对照液主斑点颜色.

  24. （3）杂质对照品与供试液自身稀释法并用 • 硫酸奈替米星中有关物质检查 • 样品150mg/ml(样液), 1.5 mg/ml(标样1), • 3mg/ml(标样2), 西梭米星对照1.44mg/ml(标样3) • 样液如显杂质斑点, 颜色不得比标3的主斑点颜色深, 其他杂质斑点不得比标1的主斑点更深, 如有一个超过, 不得深于标2的主斑点. （4） 标准药物对照法 ——选用质量符合规定的与供试品相同的药物作为对照品. • 供试品如显杂质斑点, 不得多于对照药物斑点数, 且颜色不得更深.

  25. 2.高效液相色谱法(HPLC) • 根据供试品与杂质的对照品保留时间相同, 并可以测定各杂质峰面积 • （1）外标法 （杂质对照品法）适用于有杂质对照品, 如ASA中游离SA检查 • （2）加校正因子的主成分自身对照法：适用于已知杂质的控制。以主成分为对照，用杂质对照品测定杂质的校正因子。杂质的校正因子和相对保留时间直接载入各品种质量标准中 。

  26. （3）不加校正因子的主成分自身对照法 • 将供试液稀释成与杂质限量相当的溶液作为对照溶液，取供试品溶液和对照溶液，分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱中各杂质的峰面积，并与对照溶液主成分的峰面积比较.特别适于有关物质检查。 • （4） 峰面积归一化法：w%=A杂/A总

  27. 3.气相色谱法(GC) • 用于挥发性杂质检查, 检测器:FID, 温度， 柱子:类型和规格, 进样方式和进样量 • 载气种类和流速 • 方法: (1)外标法, (2)归一化法. • (3) 标准加入法: 供试液+杂质对照品 • 进样二次 • Cx= • 4.毛细管电泳法 毛细管电泳法可以用于酶类药物中酶类杂质的检查。 C对 (Ais/Ax)-1

  28. (三) 光谱分析法 • 1. 紫外-可见分光光度法 • ——利用药物和待检杂质对光选择吸收性质的差异进行. • 例1：肾上腺素中肾上腺酮的检查 • 例2：苯丙醇中苯丙酮检查: 测定A247/A258, 苯丙醇为0.59, 当含0.5%苯丙酮时, 比值为0.79. 规定供试品的A247/A258不得0.79.

  29. 例3 地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 • 原理：二羟基蒽醌是地蒽酚制备的原料和氧化分解产物，它的三氯甲烷溶液在432nm处有最大吸收，而地蒽酚在该波长处几乎无吸收。 • 方法：地蒽酚的三氯甲烷溶液（0.10mg/ml）在432nm处测定，吸光度不得大于0.12，即相当于含二羟基蒽醌的量不大于2.0%。

  30. 2. 红外分光光度法 • IR主要用于药物中无效或低效晶型的检查。如甲苯达唑有三种晶型，其中C晶型为有效晶型，A晶型为无效晶型。A晶型在640cm-1处有强吸收，C晶型在此波数处的吸收很弱；而在662cm-1处，A晶型的吸收很弱，C晶型却有较强吸收。中国药典检查方法为：取供试品与含A晶型为10%的甲苯达唑对照品各约25mg，分别用液体石蜡法测定红外光谱。在620cm-1和803cm-1波数处的最小吸收峰间连接一基线，再在640cm-1和662cm-1波数处的最大吸收峰之顶处作垂线与基线相交，用基线吸光度法求出相应吸收峰的吸光度值，供试品在约640cm-1和662cm-1波数处吸光度之比，不得大于含A晶型为10%的甲苯达唑对照品在该波数处的吸光度之比。

  31. 3. AAS(Atomic Absorption Spectrophotometry)据蒸气相中被测元素的基态原子对特征辐射（光波）的吸收来测定该元素含量. 1)选择性好，抗干扰能力强 • 2)灵敏度高，且无焰法>火焰法 • 3)准确度高，且火焰法>无焰法

  32. 供试品加限量待测元素对照液A 测定吸收度为a • 供试品供试液B 测定吸收度为b • 判断:b(a-b)符合规定. • 如:Li2CO3中K检查: • 本品0.1g HCl(12)10ml 溶,加水至50mlB液; • 本品0.1g HCl(12)10ml 溶,加3mlK标液(10µg /ml),加水至50mlA液; • 分别测定A,应符合规定. • L: 0.03%.

  33. （四）其他方法 • 1.热分析法 (Thermal analysis): 在程序控制温度下, 测定物质的理化性质与温度关系的分析方法.研究物质在受热过程中所发生的晶型转化、熔融、蒸发、脱水等物理变化，或热分解、氧化、还原等化学变化，以及伴随发生的温度、能量或重量改变的方法

  34. (1) 热重分析 • (thermogravimetric analysis，TGA) • 程序控温下, 测定物质质量与温度的关系, T:1000-1500℃, 供试品1-20mg, 最多可达200mg. • 例: T1:CaC2O4.H2O→CaC2O4+H2O • T2: CaC2O4→CaCO3+CO • T3: CaCO3→CaO+CO2 • ⑴适合于贵重药物及空气中易氧化药物. • ⑵样品用量少, 分析速度快, 给出信息多

  35. 2.差示热分析(differential thermal analysis,DTA) 在控温条件下, 测定吸热或放热过程中供试品与参比物的温差 (△T), 用惰性物质(如石英砂)作参比物. ⑴样品发生吸热反应，样品T低于参比物，△T为负；⑵样品发生放热反应，样品T高于参比物，△T为正。  供试品发生放热反应温度高 于参比物质从而产生放热峰 供试品发生吸热反应温度低 于参比物质从而产生吸热峰

  36. 草酸钙在加热过程中有三个失重峰，相应地产生两个吸热峰和一个放热峰：草酸钙在加热过程中有三个失重峰，相应地产生两个吸热峰和一个放热峰： • 在134~226℃时，CaC2O4·H2O→CaC2O4+H2O，在DTA曲线上产生一个吸热峰； • 在398~478℃时，CaC2O4→CaCO3+CO↑，在DTA曲线上产生一个放热峰； • 在635~838℃时，CaCO3→CaO+CO2↑，在DTA曲线上产生一个吸热峰。

  37. 3.差示扫描量热法 (differential scanning calorimetry, DSC) 分析中维持样品和参比物T相同, 测定维持该温度所需能量差, 根据峰的位置, 数目, 形状等可用于药物熔点测定, 晶型及纯度分析. DSC用途：熔点测定、晶型鉴别和纯度测定——峰在横轴上位置、形状、数目与物质的性质有关

  38. 不同纯度苯甲酸的DSC曲线 标准品 98.6% 97.2%

  39. 2. 酸碱度检查法 药物中的碱性或酸性杂质检查时，可以利用药物与杂质之间的酸碱性的差异，进行检查。 • （1）酸碱滴定法：在一定指示液下，用酸或碱滴定供试品溶液中的碱性或酸性杂质，以消耗酸或碱滴定液的毫升数作为限度指标。如苯甲酸钠。 • （2）指示液法：将一定量指示液的变色pH范围作为供试液中酸碱性杂质的限度指标。如苯巴比妥。 • （3）pH测定法：用电位法测定供试品溶液的pH，衡量其酸碱性杂质是否符合限量规定。

  40. 3．物理性状检查法 根据药物与杂质在臭味和挥发性的差异、颜色的差异、溶解行为的差异和旋光性等的差异进行检查。 • 药物中如存在具有特殊气味的杂质，可由气味判断该杂质的存在。 • 药物具有挥发性，杂质不易挥发。樟脑中不挥发物的检查，取供试品2.0g，在100℃加热使樟脑全部挥发并干燥至恒重；遗留残渣不得过1mg。 • 药物自身无色，但从生产中引入了有色的有关物质，或其分解产物有颜色。采用检查供试品溶液颜色的方法 • 药物和杂质的溶解性差异可检查溶液的澄清度 • 比旋度（或旋光度）的数值可以反映药物的纯度，限定光学异构体杂质的含量

  41. 黑色的背景上 自上而下观察 第三节 一般杂质检查 • 一. 氯化物(chlorides) • 供试品→水25mL,稀硝酸10mL,置50mL纳氏比色管.加水到40mL; 另取规定量的NaCl对照液→水→40mL • 各加AgNO31mL ,加水到50 mL,放5min,从上往下比浊. • Cl-＋Ag+ → AgCl↓（白） 操作: 平行试验比较两比色管的颜色或浊度,判断杂质限量是否符合规定.

  42. 讨论： • 1. 在硝酸酸性下进行, 可加速AgCl沉淀形成, 避免其它沉淀产生. • 2. 标准NaCl含10μgCl／ml, 取用标准5-8 ml，浊度梯度明显。 • 3. 若供试液不澄清，用含硝酸的蒸馏水洗去滤纸中氯化物后过滤。 • 4. 若供试液有色，按ChP规定处理：取二份供试液，一份加AgNO3，过滤，滤液加标准NaCl作对照，与另一份供试液有相同颜色背景，→内消色法。

  43. 5. 有机氯杂质，据氯连接方式不同，采取不同方法处理样品，得无机氯，依法检查。

  44. 葡萄糖中氯化物检查 0.60g 6.0mL (浓度：10gCl－/ml)

  45. 二. 硫酸盐（sulfates）1. 在盐酸介质中进行, 可防止BaCO3, Ba3(PO4)2生成. 2. 标准K2SO4: 0.1mgSO4/ml, 比浊范围: 50 ml溶液中取1-5ml标液.3. ChP加25%BaCl25ml反应.

  46. H2O H2O 样品 标准溶液 30%硫氰酸铵 d.HCl 25ml 50ml 4ml 过硫酸铵50mg • 三. 铁盐 (iron) • 微量铁盐的存在会加速药物的氧化和降解， 硫氰酸盐法(ChP, USP)取供试品加水25ml, 稀盐酸4ml,(NH4)2S2O8 50mg, 加水至35ml, 加显色剂30% NH4SCN3ml,加H2O至50ml, 若显色则与对照液比较. Fe3+＋6SCN－→[Fe(SCN)6]3－

  47. 1. 盐酸介质中, 可防止铁盐水解, 加入(NH4)2S2O8 可使供试品中Fe2+氧化成Fe3+, 且[Fe(SCN)6]3-稳定. 2. 显色反应是可逆的，加过量的NH4SCN，使反应右移，并可消除其它阴离子与Fe3+的配位 反应（也可以适当提高酸度）。3. 标准液用Fe(NH4)(SO4)212H2O配制, 10μg Fe3+ /ml，加H2SO4防止铁盐水解, 50 ml比色液，目视比色取标液1-5ml，梯度明显。4. 用正丁醇提取反应液后比色，可以提高灵敏度。

  48. 重金属影响药物的稳定性及安全性，指在弱酸性条件下能与硫离子作用显色的金属杂质，包括Ag, Pb, Hg, As, Bi, Cd, Cu, Sb, Sn, Co, Ni等，检查时以Pb作对照，ChP(2010)收载3种检查方法． 第一法．硫代乙酰胺法:适于溶于水,稀酸及乙醇的药物, 取3支纳氏比色管检查 四．重金属（heavy metals）

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