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碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法( SAP 法)

碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法( SAP 法). 免疫组织化学实验二. 实验材料. 1 、小鼠胰腺的石蜡切片; 2 、胰岛素抗体(鼠抗人单克隆抗体); 3 、 SAP 检测试剂盒; 4 、正常羊血清; 5 、 0.01M PBS ( pH7.2 ~ 7.6 ) ; 6 、 BCIP/NBT 显色试剂; 7 、孵育湿盒。. 实验原理. ABC 法. SAP 法. 实验方法或步骤. 1 、石蜡切片脱蜡至水,蒸馏水洗, PBS 浸泡 2min ; ( 如需采用 抗原修复,可在此步后进行 ) 。

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碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法( SAP 法)

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Presentation Transcript


  1. 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法(SAP法)碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法(SAP法) 免疫组织化学实验二

  2. 实验材料 1、小鼠胰腺的石蜡切片; 2、胰岛素抗体(鼠抗人单克隆抗体); 3、SAP检测试剂盒; 4、正常羊血清; 5、0.01M PBS(pH7.2~7.6) ; 6、BCIP/NBT显色试剂; 7、孵育湿盒。

  3. 实验原理 ABC法 SAP法

  4. 实验方法或步骤 1、石蜡切片脱蜡至水,蒸馏水洗,PBS浸泡2min;(如需采用 抗原修复,可在此步后进行)。 2、10%正常羊血清封闭,室温孵育10min; 3、倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工 作液,37℃孵育45min。PBS冲洗,3×3min; 4、滴加生物素标记羊抗鼠IgG工作液,37℃孵育20min; 5、PBS冲洗,3×3min; 6、滴加碱性磷酸酶标记链霉亲和素工作液,37℃或室温孵育 20min。PBS冲洗,3×3min; 7、显色剂显色(BCIP/NBT); 8、自来水充分冲洗,封片。

  5. 结果 胰岛内可见蓝色或紫蓝色着色的阳性细胞,阳性产物见于细胞质

  6. 多聚鳌合物酶法 HRP---多聚化合物---抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining

  7. 组织抗原 一抗 HRP 多聚化合物骨架 EPOS 方法

  8. 原理:采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架,将特异 性抗体和HRP,同时标记 在多聚合物分子上,形成 HRP---多聚化合物---特异 性抗体。

  9. 步骤:一步法 特点:快速,简便,特异性强, 敏感性高 但商品化种类不全, 价格昂贵

  10. 二、EnVision法(或PowerVison) Enhanced Labelled Polymer System 原理:HRP ---多聚化合物---第二 抗体

  11. 组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚化合物骨架 第二步 第一步 PowerVision方法

  12. 特点: 敏感性高:(每个多聚鳌合物中含70个 HRP分子和10 个第二抗体) 特异性强: 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。

  13. 基本操作步骤 1. 抗原修复 2.内源性过氧化 物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体 5. 多聚骨架复合物 6. 显色

  14. 实验步骤 • 1、石蜡切片脱蜡至水,PBS洗3×3min; • 2、3%H2O2室温孵育10min,以消除内源性过氧化 物酶的活性;蒸馏水洗,PBS浸泡5min; • 3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液, 37℃ 孵育1hr; • 4、 PBS冲洗,3×3min; • 5、 滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体,37℃或室温孵 育20~30min; • 6、 PBS冲洗,3×3min; • 7、显色剂显色(AEC或DAB); • 8、自来水充分冲洗,封片。

  15. 结果:胰岛内可见棕色着色的阳性细胞,阳性产物见于细胞质。结果:胰岛内可见棕色着色的阳性细胞,阳性产物见于细胞质。

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