دانشگاه آزاد اسلامي واحد كرج

1. دانشگاه آزاد اسلامي واحد كرج

3. پایان نامه های كارشناسي ارشد

4. گروه : علوم پايه

5. رشته تحصيلي : ميكروبيولوژي

6. جداسازي، غربالگري و بررسي خصوصيات آنزيم آلفا-گالاكتوزيداز از لاكتوباسيل هاي جداشده از محصولات غذايي

7. نام و نام خانوادگي دانشجو : ميثم فرزادي ، شماره دانشجويي : 86357019877

8. به راهنمايي :شهره خاتمي • چكيده: • لاكتوباسيلوس ها نقش موثري در تقويت ميكروفلور روده ، توليد محصولات تخميري و يا توليد گليكوزيداز ها دارند. آلفاگالاکتوزيداز يك اگزو-گليكوزيداز است كه پيوندهاي انتهايي D- -گالاكتوز را در طيف وسيعي از اوليگوساكاريدهاي گالاكتوزيدي همچون : ملي بيوز ، استاکيوز ، اوربيکوز هيدروليز مي كند. اين آنزيم توسط انسان ساخته نمي شود ، بنابراين چنين اوليگوساكاريدهايي در بدن هضم نمي شوند و باعث مشکلات گوارشي چون : نفخ ، دل پيچه ، درد هاي شکمي مي شوند. • روشكار : جداسازي از باکتري هاي اسيد لاکتيک توليد كننده آلفا گالاکتوزيداز از چند محصول لبني انجام شد . ميکروارگانيسم ها در محيط MRS رشد داده شدند و سويه اي با بيشترين فعاليت آنزيم به روش رنگ سنجي با سوبستراي پارانيتروفنيل آلفا دي گالاكتوزيد ( pNP-aGal ) انتخاب شد . سويه منتخب در محيط MRS اصلاح شده با 1% رافينوز کشت داده شد. پس از برداشت با سانتريفوژ بوسيله سونيکاسيون ، سلولها پاره شدند و مخلوط حاصل، سانتريفوژ شد. سپس با سولفات آمونيوم 90% ترسيب گرديد. رسوب حاصل از مرحله قبل در بافر Mcilavine حل شد و بر روي‍ ستون ژل فيلتراسيون با Sephadex G-200 و كروماتوگرافي تعويض يوني با DEAE-cellulose خالص گرديد ، وزن مولکولي زير واحد آنزيم به روش SDS-PAGE تعيين گرديد. • نتايج : از ميان سويه هاي جداشده ، سويه YEG10 از ماست گلپايگان و سويه استاندارد DSM 20079 Lactobacillus acidofillus به ترتيب با فعاليت U/ml 3/11 و U/ml 4/15 بيشترين فعاليت آنزيم آلفا گالاکتوزيداز را نشان مي دادند. فرآورده آنزيم سويه استاندارد ، 5/18 برابر تخليص گرديد و وزن مولکولي آن kDa 45 بروش SDS-PAGE تعيين شد که مربوط به زير واحد آنزيم هوموتترامر بود. Km و Vmaxبراي اين آنزيم توسط سوبستراي pNP-aGal در حدود mM 47/0 و mol/min.mg 5/ 17 تعيين شد . حداکثر فعاليت آنزيم در دماي بهينه °C 45 و pH بهينه 5/5 بود . همچنين آنزيم ، دماهاي °C 25 تا °C 55 را تا 30 دقيقه براحتي تحمل مي کرد اما در دماي بيش از °C 60 بسرعت غير فعال مي شد . گالاکتوز درحدود 63 % فعاليت آنزيم را کاهش مي داد و Hg2+ به طور کامل فعاليت آنزيم آلفا گالاکتوزيداز را مهار مي کرد .