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Garantia de qualidade

GENÉTICA FORENSE Determinação do limiar analítico para PowerPlex16 e Identifiler Paula Cristina Margotto Polícia Federal www.paulomargotto.com.br Brasília, 19 de agosto de 2011. Garantia de qualidade. Excelência do laboratório Confiabilidade dos resultados Procedimentos rastreáveis

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Presentation Transcript

  1. GENÉTICA FORENSEDeterminação do limiar analítico para PowerPlex16 e IdentifilerPaula Cristina MargottoPolícia Federalwww.paulomargotto.com.brBrasília, 19 de agosto de 2011

  2. Garantia de qualidade • Excelência do laboratório • Confiabilidade dos resultados • Procedimentos rastreáveis • Maior peso à prova criminal

  3. Validação interna • Confirmação, por meio exame, de que os requisitos para um determinado uso são atendidos documentados • Cada kit de amplificação STR gera variações que dependem das condições específicas do laboratório. • Empresas aconselham métodos de validação baseados ou recomendado pela SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis)

  4. Determinação do limiar analítico • Ruído produzido pelo instrumento de eletroforese em capilar que não reflete moléculas de DNA • O valor pode variar com a metodologia aplicada em cada laboratório. Exemplo: capilar ,idade do laser, equipamento ,formamida, etc.

  5. Objetivo • Determinar o valor do limiar analítico para os kits PowerPlex16 e Identifiler • A SWGDAM recomenda análise de dados empíricos coletados no laboratório que se pretende avaliar. Podem ser usados diversos métodos científicos derivados de amostras negativas ou de diluição em série.

  6. 1- Método de diluições seriadas 1997 IUPAC ElectroAnalyticalCommitteeRecommendations =Escolha de amostras com perfis distintos. BS129,BS132,BS1003,PCM =Quantificação =Diluições seriadas em 1ng ,0,5 ng, 0,25ng 0,125 ng ,0,0625ng =Amplificação com os kits(volume total) =Eletroforese de Capilar =Análise no GeneMapper

  7. Verificação da Linearidade • Cálculos de Média e desvio padrão ,por cor, de RFU no Excel • Verificar a linearidade por regressão linear no gráfico de quantidade de DNA versus média de altura dos picos para cada fuorófuro. Análise de Fluoresceína PP16

  8. Cálculos estatísticos com weighted regression (regressão ponderada) análise exploratória Ferramenta do Excel disponível pelo Boston University School of Medicine. at= y intercept+3*standard error

  9. 2- Método de controles negativos • 20 dados de controles negativos • Recomendado para pouca quantidade de DNA. • Analisa-se as amostras com GeneMapperID3.2 com 1 RFU , retirando-se +/- 2 bases da posição do size standard.

  10. 2-Análise de controles negativos • 1) AT= Média de RFU de amostras brancas+3*Desvio Padrão ( valores dos resultados) Kaiser (IUPAC 1976) • 2) AT= 2*( Maior Sinal de Pico da linha de base-Menor sinal de pico de linha de base) ( valores dos resultados) Example in SWGDAM Guidelines

  11. Resultados • Controles negativos Exemplo C_NEG Identifiler

  12. Resultados Identifiler • Método de controles negativos: • 1) AT= Média +3*Desvio Padrão • FAM=8,51 RFU • VIC= 13,81 RFU • NED= 15 RFU • PET= 15,41 RFU • 2) AT= 2*(Max-Min) • FAM=38 RFU • VIC=64 RFU • NED= 48 RFU • PET= 44RFU

  13. Resultados PP16 • Método de amostras negativas: • 1) AT= Média +3*Desvio Padrão • fluorescein= 11,64 • JOE= 22,28 • TMR= 10,19 • 2) AT= 2*(Max-Min) • fluorescein= 32 • JOE= 56 • TMR= 32 C_neg PP16

  14. Resultados • Diluições seriadas

  15. Resultados Identifiler • Método de diluições seriadas : Retirou-se o ponto 0,0625 por falta de dados • FAM -62,9 RFU • VIC- 48 RFU • NED-52,11 RFU • PET- 61,49 RFU

  16. Resultados PP16 • Diluições seriadas: • Azul = 203 RFU • Verde= 252 RFU • Amarelo = 54 RFU

  17. BS132 1ng PP16 BS132 0,0625ng PP16

  18. Resultados Power Plex 16

  19. Resultados PP16 • Diluições seriadas: • Retirando-se o ponto 1 ng: • Azul =136,49 RFU • Verde =126 RFU • Amarelo=44,42 RFU

  20. Obrigada!

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