第 3 章

1. 第3章 生醫感測器

2. 3.1.1 生醫感測器的定義 • 傳統生化分析或生物檢驗技術係指利用生化或免疫學原理，以各種化學藥劑、酵素、抗體或抗原等與檢體 (例如血液、尿液) 中之待測物質 (例如葡萄糖、尿素氮、膽紅素、尿酸、膽固醇、肌酸酐及乳酸等) 作用，經一系列設計之生化反應，並配合各種光學或電極之訊號檢知器及資料處理系統來測定物質濃度。

3. 配合微小化所衍生的生醫感測器，不僅可以置入診療儀器中分析微量物質，更可能植入人體中用以追蹤生化物質或藥物的濃度，提供即時資料給醫療人員做為診治參考，而且又可製造成操作簡便、可攜帶的居家必備醫療用品。配合微小化所衍生的生醫感測器，不僅可以置入診療儀器中分析微量物質，更可能植入人體中用以追蹤生化物質或藥物的濃度，提供即時資料給醫療人員做為診治參考，而且又可製造成操作簡便、可攜帶的居家必備醫療用品。

4. 3.1.2 生醫感測器要件 • 生物體本身具有相當靈敏的感測系統，包括味、痛、嗅、聽和視覺，並包括免疫系統及內分泌系統等。但人類更想隨時能偵測自己身體生理狀況，主要是求防範於未然，另一方面期望能監控失調的身軀。例如缺乏胰島素造成的內分泌代謝失調之糖尿病患者需隨時監控其血糖值，以避免生理機能敗壞。1962年Clark及Lyons將葡萄糖氧化酵素修飾在氧氣電極上，藉由偵測氧氣的消耗量進而定量葡萄糖濃度，開啟生醫感測器 (biosensor) 的研究大門 。

5. 生醫感測器，顧名思義是利用一些工程上訊號擷取感測原理的技術，對生物樣本進行分析及偵測的一種設備。它大致上可分為前端目標物之辨識元件 (recognition element)、界面上微小變化量感知用的換能器 (transducer) 以及後端的訊號擷取系統 (acquisition system) 等三個部分。

6. 生醫感測器系統架構示意圖

7. 當生物辨識元件與待測物相互作用而結合產生物理或化學能量改變時，可依其反應發生的特性，配合光、電、力、磁、熱、流或聲波等相對應的換能器。當生物辨識元件與待測物相互作用而結合產生物理或化學能量改變時，可依其反應發生的特性，配合光、電、力、磁、熱、流或聲波等相對應的換能器。

8. 光學法 • 利用待測物與生化物質結合時所起的光學變化。量測光線的吸光度、波長與反射量，根據不同量測參數分成分光光學法、化學發光法 (螢光、磷光、冷光) 和反射光學法。

9. 聲學法 • 在壓電性晶體的兩邊施加一交流電壓，使晶體產生聲波式的機械性形變，藉以產生一固定的振盪頻率，當晶體表面因重量或黏滯度改變時，頻率隨即跟著變化，由此求出待測物質吸附量、濃度與黏滯度等變化。利用聲學法進行偵測的感測器有石英晶體微天平 (quartz crystal microbalance, QCM)、串聯式壓電石英晶體震盪法 (serial piezoelectric quartz crystal, SPQC) 及表面聲波感測器 (surface acoustic wave, SAW)。

10. 熱學法 • 待測物與生物元件結合時所產生的微量熱變化，利用熱卡計量取反應溫度變化量，配合反應焓(enthalpy) 的改變換算出待測物濃度。

11. 電化學法 • 原理是利用物質在電極表面發生氧化還原反應後所產生的電流、電阻或電位等應答訊號對濃度的關係；亦即工作電極表面與溶液中待測物質起一特定「電的變化」。

12. 3.1.3 生醫感測器性能 • 感測器的功能需經一些基本測試，才能後續推廣到臨床應用或相關工業使用，感測器特性評估如下： • 檢量線 • 線性範圍 • 靈敏度 • 反應時間 • 反應再現性 • 使用期及保存期 • 干擾物

13. 3.2　生物辨識層的設計與製作 • 生物親和性 • 生醫感測器的生物辨識元件依其是否具有生命現象而分成生物的 (biotics) 及非生物的 (abiotics)；前者又分為生物親和性 (bioaffinity) 與生物催化性 (biocatalytic)。具生物親和性的物種有免疫元件、lectins、avidin/biotin、核苷酸等。

14. 3.2.2 生物催化性與酵素固定化 • 在生化檢測上，傳統的光學法於每次檢測時均需加入新的酵素與基質，酵素因無法重複使用而大幅提升檢驗成本。為克服此點，酵素固定技術被廣為研究以求能縮短反應時間，免去測試時添加酵素的前處理步驟，促使儀器簡單化與達到微量檢測的理想。

15. 一個好的酵素固定法須符合： (1) 簡單及快速 (2) 非特異性 (3) 產生的固定化酵素需穩定及不從 基質中溢漏 (4) 固定化酵素保有其活性

16. 將酵素固定於電極表面的方法大致可分為下列幾類 ： 1.吸附法 • 此法是最簡單的酵素固定方式，主要靠著酵素與電極介面修飾物質間之氫鍵及凡得瓦力 (van der Waals force) 作用，但因其吸附力不強，故會大量流失。

17. 2.共聚合法 • 以高分子單體與酵素共價聚合，形成含酵素的高分子膜於電極表面，唯此法仍須考慮共價鍵結部分不能與酵素活性中心有關，且聚合條件必須無損於酵素活性。 3. 共價鍵結法 • 利用位於酵素上的官能基如氨基 (—NH2)、羧基 (—COOH)、硫氫基 (—SH) 及乙二醛基 (OHC—R—CHO) 等，將酵素以共價鍵方式結合於電極表面。

18. 4.半透膜法 • 利用具有微小孔隙，僅可讓小分子通透的透析膜，將其披覆於電極表面，而保酵素固定於其內。 5. 包埋法 • 係將酵素與高分子單體混合均勻後，塗布於電極表面形成薄膜或膠體，使得酵素嵌入 (entrapment) 於其中。 6. 架橋法 • 將酵素鍵結在具有兩個以上可行架橋反應 (cross-linking) 之官能基的分子，形成不溶性酵素膜，並以物理性吸附固定於電極表面。

19. 3.2.3 生醫感測器表面修飾 • 修飾電極是指在原電極表面上經由物理或化學方法處理後，使其對所欲偵測的物種具有更好選擇性及催化性。一般修飾電極因其特性與用途的不同，製備方式分為化學鍵結法、吸附法、電解聚合法及電漿法 。

20. 化學鍵結法 • 利用化學反應將一具電化學活性物種固定於電極表面，由於空氣中含有氧氣，因此電極表面通常會有大量的OH基，此OH基再與矽烷反應脫去HOR (R表烷基) 或鹵化物，此方法常用於單層膜的修飾

21. 吸附法 • 將高分子單體以點滴、噴霧或旋轉離心塗於電極表面，藉溶劑揮發，而達修飾目的。另外金與銀可與硫醇形成自組性單層膜 (self-assembled monolayer)，而後再將欲固定之生物元件導入。

22. 電解聚合法 • 藉由外加電位的控制達到修飾物種吸附於電極的目的；附著量與作用時間成一函數關係，亦即經由作用時間的控制可決定物種修飾量的多寡，進而達到多層修飾的目的。

23. 電漿法 • 利用電漿 (plasma) 使電極表面活性化，使修飾物固定於電極表面。

24. 3.2.4 生醫感測器設計原則 • 除上述所提及酵素系統、修飾電極策略及酵素固定法等外，再針對數項必備要訣簡述如下：

25. 偵測H2O2 • H2O2是許多氧化酵素如葡萄糖氧化酵素 (Glucose oxidase, GOD)、乳酸氧化 (lactate oxidase, LOD)、尿酸 (uricase)、膽固醇氧化　 (cholesterol oxidase)、膽鹼氧化 (choline oxidase) 進行催化反應後之產物，因此測定H2O2有其實用上的重要性。 • 在工作電極上電鍍Pt、Pd或Pd/Au金屬膜，期能形成高效率的H2O2捕捉網，而立即將酵素催化反應釋出的H2O2氧化，不僅求得高靈敏度、降低工作電位且避免H2O2傷害酵素。

26. 使用電子傳導媒體 • 酵素活性中心通常位於其立體結構的深處，不易與電極表面進行電子傳遞，可依電子傳導媒體穿梭於酵素活性中心與電極介面間做為電子傳遞橋樑，增加電子傳遞速率。

27. 阻隔干擾物 • 使用電流式電化學感測器最常遭遇到的困難就是干擾物的問題，由於酵素對反應本身具有極高的選擇性，造成檢測上的干擾是源自電極本身。 • 避免干擾問題方法之一是將選擇性膜置於電極及酵素層間，抑制干擾物通往電極表面。 • 另一種阻隔干擾的策略是使用某些選擇性催化劑，有效地降低待測物氧化過電位，而在較低電位下偵測，干擾物就較不會被氧化。

28. 3.3.1 電化學基本概念 • 生物檢測技術平台在於利用能夠將待檢物 (例如葡萄糖、乳酸、藥物、離子、蛋白質、抗原、有毒揮發性氣體及微生物等) 與標識體所反應出的物理或化學訊號轉換成為電學、光學、聲學或熱學等訊號以供辨識與判讀。

29. 氧化還原過程中電荷轉移情形 (a)還原反應 (b)氧化反應

30. 物質反應時所伴隨著的電荷移轉情形，通常可以透過水位差的觀念協助理解，同時亦可透過電極電位控制方式加以觀察反應的進行。亦即，當於電極上增加電位 (提供較多的電子能量) 時，若提供電子的能量高過反應溶液中的空軌域，此時電子即會往空軌域方向移動，造成還原反應的發生。

31. 當一個金屬置於含有離子的溶液中 (如將銀置於含銀離子的電解溶液)，此時金屬與電解液介面會產生電荷分離現象，這種情形一般即為電子的壓力差或稱之為電位。

32. 為了維持電解槽中的平衡 (亦即電中性)，陽極的氧化反應與陰極的還原反應會同時發生並進行，由於兩側反應可以是完全獨立進行，因而此狀況下所量測到的電壓為兩側電極之電位差，一般可稱為端電壓或是槽電壓。 • 一個標準電化學反應中，每個電極組內的反應稱之為半反應，而整體反應則稱為全反應，故電位上的端電壓可視為兩個半反應之個別電位差值。

33. 電化學反應系統

34. 3.3.2 電化學量測法 • 電位式 • 電位測定法為電化學量測方式中，最基本也常用以獲得待測物組成及濃度的一種方法，常見的酸鹼度計即為本法的主要應用實例。

35. 電位式感測器基本原理 • 透過特殊設計方式，使系統處於平衡或準平衡狀態 (quasi-equilibration)，亦即無顯著的電流通過此系統，並藉由電源供應器、電位計與電流計以產生並記錄工作電極 (working electrode) 與輔助電極 (counter electrode) 之電壓差。由於系統中的電流大小幾乎為0，因此系統兩側的電位降以及電極上可能產生的極化現象均可被忽略，而此時系統所量測到的電位可視為系統的平衡電位，簡而言之，電位變化為透過工作電極與參考電極決定 (Wk Ref)。

36. 電位定法系統架構

38. 電位法的基礎原理為Nernst方程式，一般電位式測定法進行電化學實驗進行時，研究者通常會將反應控制在電極表面之擴散控制區域內，以便利於反應狀態之觀察與模擬計算。電位法的基礎原理為Nernst方程式，一般電位式測定法進行電化學實驗進行時，研究者通常會將反應控制在電極表面之擴散控制區域內，以便利於反應狀態之觀察與模擬計算。 • 物質的氧化與還原濃度改變，通常可用Nernst方程式加以描述：

39. 電極電位的發生 • 化學反應中所伴隨著的電荷 (如電子) 轉移情形，透過觀測與記錄電荷變化可呈現反應物質之反應狀況與程度，此為所謂的電化學反應。 • 若以銅和鋅金屬為電極，且提供足夠濃度的電解質溶液 (1 M的硫酸銅與硫酸鋅)，兩側的半反應式及合併後所得之全反應如下：

40. Gibbs自由能與槽中電動勢變化可表示如下： • 式中n為電子轉移數 (此例為2)、 為法拉第常數 (96487 Cmol-1)，而化學槽中的電動勢則為E。若假設液體接合電位為0，且Gibbs自由能變化為負(∆G)，則此時電動式為正向。

41. 電位式感測器應用 • 銀/氯化銀電極：使用氯化銀的優點為其固體型態，較不易於水中溶解，於使用過程中有較佳的穩定性。 • 飽和甘汞電極 • 標準氫電極：此電極以白金/氫氣與氫離子的平衡電位做為國際標準之參考，因此又稱為一級參考電極。

42. 飽和甘汞電極的結構

43. 氫電極與另一個半反應電極

44. 於標準狀態下，當氫分子濃度為1莫耳、氫氣分壓為1大氣壓且溫度為25°C時，若將上式反應的Gibbs自由能定為0，亦即為∆G0。此時標準電極電位可表示為EH0=0，表示氫分子與質子於活性均為1時，其半反應方程式的平衡電位於任何溫度條件下均為0。於標準狀態下，當氫分子濃度為1莫耳、氫氣分壓為1大氣壓且溫度為25°C時，若將上式反應的Gibbs自由能定為0，亦即為∆G0。此時標準電極電位可表示為EH0=0，表示氫分子與質子於活性均為1時，其半反應方程式的平衡電位於任何溫度條件下均為0。

45. 其中 + 0.34 V即為銅離子的還原電位：

46. 幾種常見於電位式感測器之酵素反應

47. 伏安法 • 電化學研究中，常使用伏安法或安培法觀察工作電極與參考電極間的電位變化情形。

48. 線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry, LSV) • 線性掃描伏安法即是透過連續測試通過一個電池或電極的電流，並加以記錄電位隨時間變化之方法。 • 典型的線性掃描伏安法必須考量的基本參數包括起始電位 (initial potential,Ei)、終止電位 (end potential,Ef) 以及電位的掃描速率 (scan rate,v)。 • 利用LSV法所獲得的電流變化通常包含了法拉第電流 (ifar)、電雙層的充放電電流 (ichg)、離子或物質吸附電流 (iads) 等，一般多將後兩者視為量測系統之背景電流 (ibkg)。

49. 典型的線性掃描伏安圖 (a)為電位─時間關係 (b)為電流─電位關係

50. 電雙層的充放電電流與電位掃描速率成正比關係，若以不合適的掃描速率操作時，因電化學活性物質的反應或擴散補充不及，將造成的背景電流過大而使檢測訊號靈敏度下降，進而影響檢測極限。電雙層的充放電電流與電位掃描速率成正比關係，若以不合適的掃描速率操作時，因電化學活性物質的反應或擴散補充不及，將造成的背景電流過大而使檢測訊號靈敏度下降，進而影響檢測極限。 • 如果沒有離子的特殊吸附現象，則背景電流僅為電雙層的放電電流所貢獻，而物質發生可逆的氧化與還原反應過程中，LSV圖中呈現的波峰電位可由以下公式表示之：