第四章 中药制剂的含量分析

1. 第四章中药制剂的含量分析 浙江医药高等专科学校 中药系

5. 第四节 高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatograph HPLC） 一、定 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称为高效液相色谱法。 二、特点 高分辨，高灵敏，快速，适用范围宽，自动化程度高。 特别适合中药的定性定量分析，《中国药典》中大多数中成药的含量测定采用此法。 定 义 特 点

6. HPLC 特 点 • 与普通色谱法相比，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高等特点； • 与气相色谱法相比，有适用范围广、流动相选择性大、色谱柱可反复应用以及流出组分容易收集等优点。 • 因流动相为液体，固体样品只要求制成溶液而不需要气化，因而不受样品挥发性的限制，对于挥发性低，热稳定性差，分子量大的高分子化合物以及离子型化合物尤为适宜，如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素以及无机盐类等。

7. HPLC与经典液相色谱法(LC)及气相色谱法(GC)的比较HPLC与经典液相色谱法(LC)及气相色谱法(GC)的比较

8. 应 用 • 近年来，高效液相色谱仪器进一步得到普及，样品纯化处理方法进一步自动化、多样化，为HPLC法用于中药及其制剂的质量控制提供了应用基础和广阔的前景。 • 现已广泛应用于中药及其制剂中的有效成分及指标成分的检测、杂质或有关物质检查、有害物质或添加物的检测及中药指纹图谱的分析。 • 《中国药典》收载的564个成方及单味制剂品种中，有438个建立了含量测定，采用HPLC法分析的为412个，占94%。如牛黄解毒丸、双黄连口服液等制剂中黄芩的含量测定；牛黄降压丸、猴头健胃胶囊等制剂中白芍、赤芍的含量测定；三黄片、烧伤灵酊等制剂中大黄、虎杖的测定；香砂养胃丸、藿香正气水中厚朴的含量测定等。

9. 类 型 液-固吸附 正相色谱 反相色谱 一般反相色谱 离子对色谱 离子抑制色谱 液-液分配 键合相色谱 一般离子交换色谱 离子色谱 氨基酸分析 离子交换色谱 HPLC 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱 空间排斥色谱 胶束色谱 环糊精色谱 假相色谱 亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳

10. 主要分离类型与原理 一、液-固吸附色谱 （liquid-solid adsorption chromatography） 固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。 流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对 具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。

11. 二、液-液分配色谱 （liquid- liquid partition chromatography） 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反； 固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。

12. 三、离子交换色谱 （ion-exchange chromatography） 固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳 离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离 子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在 形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+ 阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH- 应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。

13. 四、离子色谱（ion chromatography） 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。

14. 五、离子对色谱（ion pair chromatography） 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。

15. 六、排阻色谱色谱 （size-exclusion chromatography） 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分离。小分子可以扩 散到凝胶空隙，由其中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。全部在死 体积前出峰；可对相对分子质量 在100-105范围内的化合物按质量 分离。

16. 七、亲和色谱(AC)（Affinity chromatograph） 原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等)，再连接上 配基(酶、抗原等)，这种固载 化的配基将只能和具有亲和力 特性吸附的生物大分子作用而 被保留。改变淋洗液后洗脱。

17. 四、色谱 色谱仪 1.高效液相色谱仪 一般由高压输液泵、进样阀、色谱柱、检测器和数据处理系统或色谱工作站组成。 2.工作原理 系用高压泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，通过进样阀注入样品溶液，流动相携带样品进入色谱柱进行分离，被分离成分依次进入检测器，转变成相应的电信号，由数据处理系统或色谱工作站进行处理而得到分析结果。

18. 仪器简介 • 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器及色谱数据处理系统组成。 • 输液泵是将贮液器中的流动相以高压连续不断地泵入装有固定相的色谱柱； • 进样器一般采用带有定量管的六通进样阀； • 色谱柱管一般为直形不锈钢管，常量柱内径2～6mm，长度5～30cm，样品注入量一般为数微升，柱温为室温； • 最常用的检测器为紫外吸收检测器，尚有二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光检测器等。

19. 基本原理 1.塔板理论用于计算理论塔板数及塔板高度，衡量色谱柱的柱效。在系统适用性试验中，其理论塔板数不得低于各品种项下规定的最小理论塔板数。 n＝5.54(tR/w1/2)2 H＝L/n

20. 2.速率理论 • 液相色谱与气相色谱的速率理论方程式的主要差别表现在纵向扩散项(B/u)和传质阻抗项(Cu)上。在HPLC中流动相为液体，黏度大，柱温低，扩散系数Dm很小，因此纵向扩散项B/u可忽略不计，其速率方程式为： • H＝A＋Cu • C＝Cm＋Csm＋Cs • 式中Cm、Csm、Cs分别为组分在流动相、静态流动相和固定相中的传质阻抗系数。对于化学键合相色谱，“固定液”是被键合在载体表面的单分子层，Cs≈0，则C＝Cm＋Csm。 • 在HPLC中，当流动相的线速度大于lcm/s时，流动相的流速与板高基本呈直线关系，为兼顾柱效与分析速度，多采用较低流速；内径2～4.6mm的色谱柱，多采用lml/min。

21. 实验条件选择 1.色谱柱的选择 • 色谱柱由柱管和固定相组成，填充剂的性能与色谱柱的填充，直接影响色谱柱的柱效及分离度。 • 孔径大于30nm的填充剂适于分离分子量大于2000的化合物； • 孔径小15nm的填充剂适于分离分子量小于2000的化合物。 • 高效液相色谱法的填充剂应为耐高压、粒度小而均匀的球形颗粒。 • 色谱柱的填充常采用匀浆高压(600～l000kg/cm2)装柱，技术性很强，目前大部分实验室都使用已填充好的商品柱。

22. (2)液-液分配色谱的固定相： • 由载体和固定液组成。按两者的结合方式不同分为机械涂层固定相和化学键合固定相。 • 机械涂层固定相是将固定液涂在载体上，使用过程中，固定液极易流失，目前已淘汰。 • 化学键合固定相是将固定液通过化学反应键合在载体上，化学稳定性好，使用过程中不流失，热稳定性好，可选用的流动相范围广。

23. 化学键合固定相分类： • ①非极性或中等极性键合相：如十八烷基硅烷键合硅胶(ODS或C18)、辛基硅烷键合硅胶(C8)、甲基与苯基硅烷键合硅胶(可诱导极化)、醚基硅烷键合硅胶(ROR’)等，常用作反相色谱系统的填充剂。 • ②极性键合相：如氨基硅烷键合硅胶(NH2)、氰基硅烷键合硅胶(CN)等，常用作正相色谱系统的填充剂。 • ③离子型键合硅胶：如强酸性磺酸型键合硅胶(-SO3H)、强碱性季铵盐型键合硅胶(-NR3Cl)，常用作离子交换色谱的填充剂。

24. 液-液分配色谱固定相的选择： • 以硅胶为载体的键合固定相适用于pH2～2.8的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当需使用pH大于8的流动相时，应采用耐碱的填充剂，如有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机－无机杂化填充剂等。 • 色谱柱的选择应考虑被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素。大多数药物可用C18反相(ODS)柱加以分离测定。在建立HPLC分离方法时，可先试用反相柱，若效果不理想再改用正相分配色谱柱(氨基柱、氰基柱)或硅胶吸附色谱柱。对于解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱测定；对于脂溶性的药物异构体的测定可采用硅胶吸附色谱柱。

25. 流动相选择 • (1)液-固吸附色谱的流动相：在液固吸附色谱法中，流动相对分离的影响比较显著，控制分离选择性和分离速度主要靠选择合适的流动相来实现。一般采用二元以上的混合溶剂系统，在低极性溶剂如烃类中，加入适量极性溶剂如氯仿、醇类。 • (2)化学键合色谱的流动相：可采用固定比例(等度洗脱)或按规定程序改变比例(梯度洗脱)的溶剂组成作为流动相系统。 • 在液-固吸附色谱法中，一般采用二元以上的混合溶剂系统，在低极性溶剂如烃类中，加入适量极性溶剂如三氯甲烷、醇类等以调节溶剂系统的极性； • 在液-液分配色谱法中，流动相极性小于固定相极性称为正相色谱；流动相极性大于固定相极性称为反相色谱。正相色谱用于分离极性及中等极性的分子型化合物；反相色谱用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。在药物分析中，反相色谱应用最广。在反相色谱法中，由于固定相是非极性的，所以，流动相极性越弱，其洗脱能力越强。典型的反相色谱法是用非极性固定相，常用十八烷基键合相(ODS或C18)，流动相用甲醇-水或乙腈-水。洗脱时，极性大的组分先流出色谱柱，极性小的组分后流出色谱柱。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%。

26. 反相键合相色谱的流动相常选用下列三种： • ①部分含水溶剂：以水为基础溶剂，再加入一定量可与水互溶的有机极性调节剂(如甲醇、乙腈、四氢呋喃)，适用于分离中等极性、弱极性药物，常用甲醇－水、乙腈－水系统。 • ②非水溶剂：用于分离疏水性物质，尤其在柱填料表面键合的十八烷基硅胶量较大时，固定相对疏水化合物有异常的保留能力，需用有机溶剂，可在乙腈或甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃(称非水反相色谱)。 • ③缓冲溶液：适用于可溶于水并可解离的化合物，如蛋白质、多肽及弱酸、弱碱类成分。缓冲液及其pH值不同会影响组分的保留值，常用的缓冲液有三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液，选用的pH值应使溶质尽可能成为非解离形式，使固定相有较大保留能力(反相离子抑制色谱)。

27. 正相键合相色谱的流动相通常采用饱和烷烃(如正己烷)中加入异丙醚等极性较大的溶剂作为极性调节剂，通过调节极性调节剂的浓度来改变溶剂强度，常采用二元以上的混合溶剂系统，可用薄层色谱(TLC)探索合适的流动相。正相键合相色谱的流动相通常采用饱和烷烃(如正己烷)中加入异丙醚等极性较大的溶剂作为极性调节剂，通过调节极性调节剂的浓度来改变溶剂强度，常采用二元以上的混合溶剂系统，可用薄层色谱(TLC)探索合适的流动相。 • 反相离子对色谱的流动相为极性较强的水系统混合溶剂，最常用的是甲醇－水、乙腈水中加入0.003～0.01mol/L的离子对试剂，调节有机溶剂的比例使组分A值在适宜范围。离子对试剂的性质和浓度、流动相的pH值及流动相中有机溶剂的性质和比例都会影响组分的保留值和分离的选择性。

28. 洗脱方式 • 有等度洗脱和梯度洗脱两种。 • 等度洗脱系指在同一分析周期内流动相的组成及配比保持恒定的洗脱方式，具有操作简便、色谱柱易再生等优点，但仅适合于分析组分数较少、性质差异不大的样品； • 在一个分析周期内，按一定的程序不断改变流动相的组成、配比及pH值等，称为梯度洗脱。它可使复杂供试品中性质差异较大的组分，都能在各自适宜的分离条件下分离。

29. (3)蒸发光散射检测器(ELSD)：为一种通用型检测器，主要用于检测糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、 维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等成分。 • (4)电化学检测器(ECD)：电化学检测器包括极谱、库仑、安培和电导检测器。前三种统称伏安检测器，适用于能氧化、还原的有机物质的检测；后一种适用于离子色谱的检测。其中，安培检测器的应用最广泛，对有机还原性物质的检测限可达1×10-12g/ml，灵敏度高，尤其适用于痕量组分的分析，但不能检测不能氧化、还原的物质。 • (5)示差折光检测器(RID)：为一种通用型检测器，利用组分与流动相折射率之差进行检测。 • (6)化学发光检测器(CLD)：为近年来发展起来的高选择性、高灵敏度的新型检测器。特点是设备简单、自身发光(无需光源)、价格便宜。化学发光反应常用酶为催化剂，将酶标记在待测物、抗原或抗体上，可进行药物代谢分析及免疫发光分析，尤其是痕量组分的测定，最小检测量可达10-12g。

30. 质谱检测器

31. 含量测定方法 二、含量测定 内标法 外标法制剂分析大多采用此法 1.系统适应性试验 包括色谱柱的理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中分离度和重复性更具实用意义。 系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对色谱系统进行试验，应符合要求。否则可对色谱分离条件作适当的调整。

32. （1）色谱柱的理论板数（n）考察柱效 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的对照物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按下式计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最 小理论板数，应改变色 谱柱的某些条件（如柱 长、载体性能、色谱柱 充填的优劣等），使 理论板数达到要求。

33. （2）分离度（R） 考察分离效果 在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定，分离度应大于1.5。

34. （3）重复性 考察测量的精密度 在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0％。 （4）拖尾因子（T） 考察色谱峰的对称性，保证测量的准确度。特别是采用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。 式中: W0.05h为0.05峰高处的峰宽； d1为峰极大至峰前沿之间的距离。

35. 2.对照品溶液的制备 3.供试品溶液的制备 4.测定法 将上述两种溶液分别注入色谱仪，记录色谱图，按下式计算被测成分的含量。 （1）求出供试液中被测成分的浓度C供 （2）求出药品中被测成分的含量 A供 C供＝C对 A对 C供 X 稀释倍数 含量（W/W）＝ 取样量

37. 应用实例 1.牛黄解毒片中黄芩的含量测定 本品由牛黄、大黄、黄芩、冰片、石膏等八味中药制成。中国药典以黄芩苷为指标，采用HPLC测定其中黄芩的含量。 （1）色谱条件与系统适应性试验 固定相：用十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相：甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2），流速1ml/min； 检测器：紫外检测器，检测波长为315nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。 （2）对照品溶液制备 精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，以甲醇溶解配成每1ml中含31.2µg的对照品溶液。

38. （3）供试品溶液制备 取牛黄解毒片20片，剥去糖衣，精密称定（6.254g），研细，精密称取1.045 g，加70%乙醇30ml，超声处理20分钟，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤于同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。 （4）测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl进样，测得对照品及供试品中黄芩苷的峰面积分别为A供＝4340441，A对＝3945856。

39. 4340441 =31.2(µg/ml) × =34.3(µg/ml) 3945856 【解答】①采用的是外标法还是内标法？ ②流动相中为什么要加入少量磷酸？ ③计算黄芩苷的含量 （保留两位有效数字）。 求算供试液中黄芩苷的浓度

40. C供×稀释倍数×平均片重 黄芩苷（mg/片）= -3 取样量 ▲求算药品中黄芩苷的含量 =0.51 34.3（µg/ml）×10 ×50ml×312.7mg/片 = 1045mg

41. 2.藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定 本品由苍术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷等十味中药制成的液体制剂，每支装10ml（标示装量）。其中厚朴为主药之一，故《中国药典》采用HPLC，以厚朴酚及和厚朴酚的总量为指标，控制厚朴的含量。 （1）色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-水（50:20:40）为流动相；检测波长294nm。理论板数按厚朴酚峰计算应不低于5000。 （2）对照品溶液的制备 取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含厚朴酚0.2mg、和厚朴酚0.1mg的溶液，摇匀，即得。

42. （3）供试品溶液的制备 精密量取装量项下的本品5ml，加盐酸2滴，用氯仿振摇提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解并精密稀释至10ml，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。 （4）测定法 精密吸取上述三种溶液各10μl，分别注入液相色谱仪测定，根据对照品的峰面积（AR厚 AR和）以及供试品中被测成分的峰面积（AS厚 AS和）计算厚朴的含量。本品每支含厚朴以厚朴酚（ C18H18O2）及和厚朴酚（C18H18O2）的总量计，不得少于5.8mg。 混合对照品 和厚朴酚 厚朴酚 样品

43. 【解答】①采用的是外标法还是内标法？②为什么要酸化样品溶液，再用氯仿萃取？③计算厚朴的含量 （保留两位有效字）。 【含量计算】 ① 分别求算供试液中厚朴酚及和厚朴酚的浓度（mg/ml） ②分别求算药品中厚朴酚及和厚朴酚的含量（mg/支） C对为厚朴酚或和厚朴酚对照溶液的浓度； A供为供试品中厚朴酚或和厚朴酚的峰面积； A对为对照品厚朴酚或和厚朴酚的峰面积。 C供mg/ml ×10ml ×10ml×标示装量ml/支 含量（mg/支）＝ 5ml ×5ml （ 取样量）