第一章 微生物常规鉴定技术

1. 第一章 微生物常规鉴定技术 一、接种、分离纯化和培养技术 二、形态结构和培养特性观察 三、生理生化试验 四、血清学检验

2. 第一节 微生物检验基本知识 • 一 接种 • 　将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

3. １ 接种工具和方法 　接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

4. 常用的接种方法有以下几种： • １）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 • ２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 • ３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

5. ４）浇混接种 又称混菌法或倾注法，该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 • ５）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 • ６）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物钟，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

6. ７）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 • ８）活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。

7. ２ 无菌操作 • 　　培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

8. 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞

9. 二 分离纯化 • 含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。 • 如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。 • 在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。

10. 1 稀释平板法（倾注法和涂布法）

11. 2 划线法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法

12. 3 富集培养法 • 　富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。

13. 4 厌氧法 • 石蜡法： • 厌氧培养箱法: • 亨盖特滚管法：

14. 三 培养 • 1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。 • ２、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。

15. 第二节 微生物常规鉴定技术 • 一 形态结构和培养特性观察 • １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

16. ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。 • １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。

18. ２）霉菌和酵母菌的培养特征： • 大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。

19. 霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

20. 二 生理生化试验 • 　　微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

21. １ 糖酵解试验 • 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。

22. 试验方法： • 以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。

23. 本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。

24. ２ 淀粉水解试验 • 　　某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

25. 试验方法： 以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。 • 注意：淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

26. ３甲基红（Methyl Red MR ）试验与V-P(Voger—Proskauer )试验 • 1)．培养基：缓冲葡萄糖蛋白胨水 • 磷酸氢二钾 5克 多胨 7克 • 葡萄糖 5克 蒸馏水 1000毫升 • pH 7.0 • 溶化后校正pH，分装小试管，每管l毫升，高压灭菌12l ℃15分钟。 • 2)．试剂： • ① 甲基红试剂：甲基红0.1克， 95％酒精 300毫升，蒸馏水 200毫升。 • 先将甲基红溶于酒精中，然后加入蒸馏水。 • ②6％a一萘酚酒精溶液， 40％氢氧化钾溶液 • 3)．试验 • 自琼脂斜面挑取少量培养物接种于缓冲葡萄塘蛋白胨水中，36士l℃培养2～4天，哈夫尼亚菌则应在22～25℃中培养，进行结果检查。

27. 4) 甲基红（Methyl Red MR ）试验与V-P(Voger—Proskauer )试验结果检查 • 甲基红(MR)试验 • 某些微生物如大肠杆菌，志贺氏菌、产气杆菌等，在糖代谢过程中产生丙酮酸，丙酮酸再进一步分解生成乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸类增加愈多，则培养基中的pH值愈下降，当降至pH4.5以下时，甲基红指示剂呈红色，即为阳性反应，如pH值高于4.5则培养物呈黄色，即阴性反应。因此，在培养物中加入一滴甲基红试剂，立即可观察上述结果。

28. V—P(Voger—Proskauer)试验 • （丙酮酸） （乙酰甲基甲醇） • （二乙酰） （胍） （红色化合物）

29. 4 靛基质试验 （色氨酸） （靛基质） 某些微生物如大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等含有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，产生靛基质(indolo)。当它与对二甲氨基苯甲醛(P—dimethyl aminobenaldehyde)作用，形成玫瑰靛基质(rosindole)而呈红色。

30. 试验方法： • 试剂：L一色氨酸0.1克 0.01M pH6.8磷酸缓冲盐水 100毫升 贮存于4℃ • 方法：在上述试剂中加入大量纯培养菌，使成悬液，置36士l℃水浴中l小时，然后滴加对二甲基氨基苯甲醛液，观察结果。 • 结果：阳性者在液面呈粉红色至玫瑰红色。

31. 5 硫化氢试验 • 某些微生物(如沙门氏菌、变形杆菌等)能分解蛋白质中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸等)产生硫化氢，硫化氢遇到铅盐或铁盐，则发生作用而生成黑色的硫化铅或硫化铁。 • COOHCHNH2CH2S·SCH2NH2COOH+4H2→2H2S+2NH3+2CH3COOH+2HCOOH • H2S+Pb(CH3COO)2→PbS ↓+2CH3COOH • (硫化氢) (醋酸铅) 硫化铅(黑色沉淀) • 培养基配制及试验方法见GB4789.28中2.14

32. (微量快速法)： • 试剂：盐酸半胱氨酸O.1克 O.02MpH7.0磷酸缓冲盐水 100毫升 贮存于4℃ • 方法：取上述试剂O.4毫升，挑取一环纯培养物，制成悬液，于管口棉塞间夹一条醋酸铅试纸(不可接触试剂)，于36士l ℃中每15分钟观察一次，直至l小时结束。 • 结果：试纸条呈棕色至黑色为阳性。

33. 6 尿素酶试验 • 有些微生物含有尿素酶，能分解培养基中的尿素产生氨，使培养基变成碱性。酚红指示剂变为红色。

34. 培养基配制及试验方法见GB4789.28中2.15 • (微量快速法)： • 试剂：尿素 10克 0.2M pH6.5磷酸缓冲液 100毫升 • 0.4％酚红液 • 取10％尿素液100毫升,加入0.4 ％酚红液0.6毫升,于4 ℃保存,试剂的颜色为黄色，如变成淡红色，说明尿素已被分解，不宜使用。 • 方法：取一灭菌试管。加入上述试剂 0.2毫升，再加入一环纯培养体，于36士l℃培养10~30分钟观察结果。 • 结果：呈淡红色为阳性。

35. 7 硝酸盐还原试验 某些微生物如沙门氏菌能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性环境下，亚硝酸盐可与氨基苯磺酸结合成重氮盐，若再遇a一萘胺可形成红色偶氮化合物。 培养基及试剂的配制,试验方法及结果观察见GB4789.28—2003.2.17

36. 试剂；硝酸钠0.05克溶于0.025 M pH6.8 磷酸缓冲液中，于4℃保存。 • 方法：取试剂0.2毫升装一支小试管内，取一环纯培养物，制成悬液，置36士l℃培养1小时，然后加入甲液和乙液各0.2毫升，立即观察结果。 • 结果：阳性者呈红色。

37. 8 过氧化氢酶试验 • 某些微生物能产生过氧化氢酶，将过氧化氢分解而放出氧气。 • 过氧化氢酶 • 2H2O2一一→2H20+02↑(气泡) • 多数需氧或兼性厌氧微生物皆能产生过氧化氢酶，而一般厌氧微生物不产生此酶． • 试剂：3％过氧化氢溶液 • 方法：取一环纯培养体置于洁净的小试管内，滴加3％过氧化氢液2毫升，30秒钟内产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。

38. 9 氧化酶试验 • 具有氧化酶的微生物，可使盐酸二甲基对苯二胺脱氢，氧化成有色的醌类化合物， • 试剂配制及实验方法见GB4789.28--2003．2.18

39. 10 三糖铁（TSI）琼脂试验 • 　　试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。 • 　　本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

40. 提问：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。应该产生什么现象？提问：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。应该产生什么现象？ • 　　　大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。应该是什么现象？ • 　　　沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气。 • 下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？

41. 三、血清学试验 • 血清学检验是报据抗原与抗体在体外发生特异性结合，并在一定条件下出现各种抗原一抗体反应的现象，如凝集反应、沉淀反应等。因抗体存在于血清等体液中，在试验中一般采用血清，故而又称为“血清学反应”。血清学反应可用已知抗原检测未知抗体，也可以用已知抗体检测未知抗原，这一技术常用来对某些病原菌进行鉴定，以及对某些疾病作早期诊断，在食品卫生微生物学检验工作中，血清学检验也是一项很重要的检验方法。

42. (一)血清学反应的基本特点 • 1．高度的特异性和交叉性 • 2．可逆性 • 3．需要合适的浓度比抗原与抗体的结合，两者之间需要适当比例，才能结合成大的分子集团沉淀下降成可见的反应现象。 • 4．两阶段性

43. (二)影响血清学反应的主要因素 • 1．电解质 一般用0．85％的氯化钠溶液作为抗原和抗体的稀释液，如无电解质存在，则不出现可见反应。 • 2．pH值 适合的pH值是抗原抗体反应的必要条件之一，大多数血清学反应的适宜pH值为6～8。pH值过高或过低可直接影响抗原、抗体的理化性质，如pH值降至3时，因接近细菌的等电点，引起非特异性的酸凝集，造成假象，影响血清学反应的可靠性。 • 3．温度 一般常在37℃左右进行试验。 • 4．杂质异物 反应中如存在与反应无关的蛋白质、类脂、多糖等非特异性物质时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。

44. (三) 常用的血清学检验方法 • 1 凝集反应 • 2 沉淀反应 • 3 免疫荧光标记技术 • 4 补体结合反应 • 5 中和反应