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第五章 应用微生物的基因操作系统

第五章 应用微生物的基因操作系统. 大肠杆菌系统 酿酒酵母系统. 大肠杆菌系统. 大肠杆菌系统的特点 载体 质粒载体 噬菌体载体 粘粒 (cosmid) 载体 受体 感受态 (competance) 细胞转化. 大肠杆菌系统的特点. 基因工程是从大肠杆菌系统发展起来的 生长迅速 技术成熟 基因组测序完成. 大肠杆菌系统的质粒载体. pBR322 pUC 质粒 T 载体. pBR322. 早期应用广泛的克隆载体， 4362bp ，有 Ap 和 Tc 两个抗药性基因

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第五章 应用微生物的基因操作系统

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Presentation Transcript

  1. 第五章 应用微生物的基因操作系统 • 大肠杆菌系统 • 酿酒酵母系统

  2. 大肠杆菌系统 • 大肠杆菌系统的特点 • 载体 质粒载体 噬菌体载体 粘粒(cosmid)载体 • 受体 • 感受态(competance)细胞转化

  3. 大肠杆菌系统的特点 • 基因工程是从大肠杆菌系统发展起来的 • 生长迅速 • 技术成熟 • 基因组测序完成

  4. 大肠杆菌系统的质粒载体 • pBR322 • pUC质粒 • T载体

  5. pBR322 • 早期应用广泛的克隆载体，4362bp，有Ap和Tc两个抗药性基因 • 单一切点的限制酶：AvaI, PstI, BamHI, PvuII, ClaI, SalI, EcoRI, HindIII • Ap: PstI • Tc: BamHI, HindIII, SalI

  6. pBR322载体重组子的筛选 Aps Tcs Ap Tc+CycS Apr Tcr ------ Apr Tcr ----------- Apr Tcs Apr Tcs Apr Tcs D-cycloserin: D-Ala（细胞壁组分之一）的结构类似物

  7. pUC质粒 • Ap抗性 • LacOZ中有多克隆位点(MCS)，可在X-gal平板上直接挑选

  8. T载体 • pBR322（复制原点，抗药性） • T-噬菌体启动子 • 多克隆位点 • His尾

  9. 穿梭质粒 • 质粒一般只能在特定的寄主中复制，能穿梭于不同寄主中复制的质粒称为穿梭质粒。 • 大肠杆菌系统的成熟性，带来了穿梭质粒载体使用上的方便性。

  10. λ 噬菌体类载体 • λ噬菌体基因组 双链DNA,48502bp,50基因 EcoRI (12bp)cos A F J att int rec N CI P Q S R cos 头尾合成 重组区 调节区 复制区 裂解区 J-N为非必须区，与噬菌体生长及噬斑形成无关，可被消除或取代，当λ-DNA分子大小为其全长的75%-105%(38~52 kb)时，可以形成感染性噬菌体颗粒。

  11. λ 噬菌体类载体的构建 • 用突变、缺失等方法，减少限制酶的切割位点，除去必须区内的限制酶位点。 EcoR I S I ligase • 在非必须区内进行基因操作，切除一定的DNA片断，有目的的引入一些DNA片断。

  12. 插入型载体 • λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有一个酶切位点，DNA重组时外源DNA将在这个位点插入。 EcoR I b538CI imm434 整个基因组缺失18%，最大插入为 9 kb CI:编码使噬菌体不能复制的阻遏蛋白，噬菌斑混浊，插入后CI失活，噬菌斑透亮

  13. 取代型载体 • λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有2个酶切位点，DNA重组时外源DNA将取代这2个位点间的片段。 EcoR I EcoR I SupE 整个基因组缺失27%，可插入 3-18 kb SupE，抑制基因，抑制LacZ基因的amber突变体，在X-gal平板上产生蓝色噬菌斑,取代后噬菌斑无色

  14. 粘粒(cosmid)载体 • 插入外源DNA片断的大小： 质粒：<10kb 噬菌体：10-20kb 粘粒：40kb • 粘粒(5-10kb): COS+抗药性基因+限制酶单切位点 • 粘粒  限制酶酶切  连接外源DNA(ligase)  体外包装（需要2株带λ溶源突变体的E.coli，冻融后提取包装所需的各种蛋白质） 感染受体细胞

  15. 感受态细胞转化 • 感受态：细胞处于一种特殊的生理状态，在这种状态下可以吸收外源DNA。 • 感受态的出现：（1）一种可扩散的感受态因子的存在；（2）细胞外层的一些组分，如膜蛋白等状态的变化。 • 有些细胞在生长的某一阶段会自发出现感受态，但基因工程中所用的微生物在正常培养条件下不会自发出现感受态，需要经过人工的特殊处理。

  16. 大肠杆菌的感受态转化 • 过程： 细胞培养至对数前期冷冻离心收集细胞CaCl2浓缩 冰浴再冷冻离心收集细胞 CaCl2再浓缩4°C放置感受态细胞与DNA混合冰浴热冲击选择性平板37 °C培养 • 机制： 二价阳离子(Ca  Ba  Sr  Mg)改变了细胞膜结构，使之在低温时能与DNA结合，热脉冲使结合在膜上的DNA有0.1%-1%可以抗DNase，并使抗DNase的 DNA进入细胞。 • 转化效率 • 卫星菌落

  17. 受体菌 基因工程受体菌的要求 • 有能有效接受外源DNA的手段（转化、感染、结合…） • 外源DNA能忠实地进行复制（一般应是 rec-, r-, m-） • 有利于基因操作与生产的性状（鉴别、生长、分泌、后处理等） • 生物学安全性（不在人体内生存，不在非培养条件下生存，不易转移等）

  18. 安全受体菌E.coli X1776 • F- -无性因子 • tonA53-抗噬菌体T1、T5、Ф80 • dapD8-二氨基庚二酸缺陷型 • minA1, minA2-产微细胞 • supE42-限制质粒任意转移，只要质粒上有amber突变，则只能在有amber突变抑制基因的宿主中复制 • 40[gal-uvrB]-作为受体转化能力增强 • λ– -无λ噬菌体 • nalA25-萘啶酮酸抗性，便于监视 • thyA57-胸腺嘧啶缺陷型，与dap一起，无dap、thy时易死亡，使DNA更易分解 • 29[bioH-asd]-生物素缺陷-天冬氨酸半醛缺陷，中间有不能利用甘油、麦芽糖、需要苏氨酸、甲硫氨酸等 • cycA1,cycB2-环丝氨酸抗性，便于监视，自然界几乎没有兼抗nal、cyc两种药物的 • Rfb-2-粗糙突变体，对胆汁酸、离子去污剂、抗生素敏感 • hadR2-对外源DNA无限制作用

  19. 启动子 TTGACA TATAAT 结构基因 -35 -10 SD序列 terminator RNA 聚合酶() Pribnow box 转录开始 回文序列 识别位点  结合位点 RNA 聚合酶：’ ：识别，：保持构型，：起始催化，’ ：与DNA模板结合 SD序列：Shine-Dalgarmo box，富含AT(Tm低)，翻译时mRNA与核 糖体16sSNA结合位点

  20. 问题 真核基因有内含子，一起转录后得到错误翻译产物 真核基因无SD序列，翻译时缺少16S核糖体的结合位点 真核蛋白质易被细菌蛋白酶降解而得不到产物 对策 用cDNA克隆的策略或用RT-PCR获得基因，即不含内含子 将真核基因克隆在原核启动子的下游，以利用SD序列 用蛋白酶缺陷型宿主或克隆蛋白酶抑制剂基因，或使产生融合蛋白然后再加工成所需蛋白 真核基因的表达

  21. 酿酒酵母系统 • 酿酒酵母系统的特点 可食、安全，适用于药品生产 遗传背景最清楚的真核细胞 在简单培养基中生长迅速、细胞密度高 基因操作容易 可分泌胞外蛋白 可正确表达真核基因产物

  22. 酵母载体 • 游离(episomal)载体与整合(integrating)载体 • ARS(autonomous replication sequences)载体 • ARS/CEN(centromeric sequences) • 2质粒类载体(2-based vector) • 整合型载体 • 人工染色体(yeast artificial chromosome YAC)

  23. ARS载体 • 拷贝数较多（可达20） • 有丝分裂时不稳定（20%/代），甚至在有选择性压力下有质粒细胞的比例也很低 • 难于用来表达外源基因

  24. ARS/CEN 加上着丝序列 • 稳定性增加 • 拷贝数减少（1-2) • 只能在要求表达水平不高时使用

  25. 存在于多数酵母菌中的内源质粒 拷贝数高（~100） 遗传稳定（10-4/代） 大小为6.3kb（6318bp），有2个599 bp的反向重复序列，编码4个基因： A (FLP): 编码位点专一的重组酶，启动有关的反向重复序列里的FLP重组靶位FRT（FLP recombination targets），形成反转 B (Rep 1)、C (Rep 2): 保证质粒稳定、高拷贝在酵母中繁殖 D: 复制起始点 3714-4312 C D form A B 939-341 A B C form B D A 2质粒

  26. 整合型载体 • YIP5 pBR322 + 酵母选择标记 无酵母复制子，当转入酵母细胞时，只能利用其酵母标记基因与染色体同源区重组后插入染色体中

  27. 酵母系统的转化 • 原生质体转化 • 感受态转化(LiCl or LiOAc) • 电穿孔法

  28. 酵母系统的选择性标记 • 营养缺陷型选择标记 LEU2, TRP1, URA3, HIS3 • 显性(dominant)选择标记 氨基葡萄糖苷抗生素 (G418)抗性， 铜抗性CUP1 • 自动选择(autoselection) 编码酵母Killer Toxin（致死毒素）基因和免疫基因，无质粒细胞被有质粒细胞杀死，故可自动选择转化子

  29. 第六章 酶工程与生物转化 • 基本概念 • 重要的微生物生化反应与酶 • 生物转化 • 酶分子的改造 • 固定化酶与固定化细胞

  30. 酶工程 酶工程：酶制剂的生产和应用 • 改善酶的生产 • 产量 • 工艺 • 成本 • 改善酶的性质 • 酶的活力 • 底物特异性 • 反应条件 • 酶的稳定性

  31. 化学酶工程与生物酶工程 • 化学酶工程 • 分离纯化 • 化学修饰 • 固定化 • 生物酶工程 • 基因工程酶 • 分子酶工程 • 生物转化

  32. 酶的特点 • 催化性 • 专一性 • 可调性

  33. 酶的基本性质 • 酶活力 • 米氏常数Km V = Vmax S/(Km + S ) • 最适温度 • 最适pH • 稳定性（温度、 pH ） • 底物专一性 • 各种物质的影响

  34. 微生物是应用酶的最重要来源 微生物酶的特点： 资源的丰富性 来源的稳定性 生产的经济性 使用的便利性

  35. 微生物的生化反应 • 水解与缩合： 多糖  寡糖  单糖 多肽  寡肽  氨基酸 核酸  核苷酸 脂肪  脂肪酸 + 甘油 CN + H2O  CO-NH2 • 氧化还原： CH  C-OH  CHO  COOH CHO  C-OH + COOH C=C  CH-CH • 转氨与脱氨： C-OH  C- NH2 C=O  C- NH2 • 其他

  36. 重要的工业酶制剂 • α-淀粉酶：淀粉糊精，B.subtiiius, pH5~6,T~60°C • 葡萄糖淀粉酶：淀粉葡萄糖（外切非还原端-1,4糖苷键），A.niger, pH4~5, T~60 °C • 蛋白酶：肽键水解，蛋白质胨示肽氨基酸，碱性、中性、酸性 • 脂肪酶：水解脂肪，在油、水界面反应

  37. 其它重要糖苷酶 • ß-淀粉酶 • 纤维素酶 内切β－葡聚糖苷酶(EC3.2.1.4) 纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91) β－葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21) • 木聚糖酶 • ß-半乳糖苷酶 • 葡萄糖异构酶 • 环糊精葡萄糖基转移酶

  38. 淀粉制葡萄糖

  39. 淀粉糖化过程 淀粉浆  α-淀粉酶 液化液（DE12~18)  葡萄糖淀粉酶 糖化液（DE95~96)  干燥、结晶 DE：右旋糖当量

  40. 果葡糖浆 葡萄糖异构酶 葡萄糖 果糖 甜度 0.7 1.5~1.7

  41. 低聚糖 • 双歧因子 • 抗龋齿 糖苷酶 多糖 低聚糖（寡糖）

  42. 饲料用酶 • 补充幼龄禽畜的内源酶：α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶 • 非淀粉多糖水解酶：纤维素酶、木聚糖酶、 ß-葡聚糖酶、果胶酶 • 植酸酶

  43. 芳香族化合物的降解 • 苯的生物降解 苯   邻苯二酚   降解 • 取代苯的生物降解 • 多环芳烃的生物降解

  44. 手性化合物的生物拆分与生物合成 • 关于手性的基本概念 • 手性化合物：含不对称碳原子具有光学活性的化合物 • 手性拆分：外消旋体  一种对映体 • 手性合成：立体选择性催化合成手性化合物 • 手性生物拆分用酶： 水解酶、氧化还原酶、消旋酶 • 手性生物合成用酶： 水解酶、氧化还原酶、裂解酶、异构酶、转移酶、连接酶等

  45. 辅酶与辅酶再生 • 许多氧化还原反应涉及辅酶等辅助因子，如NAD、NADP、FMN等 • NAD作为辅助因子与300个以上细胞反应有关 • NADH/NAD+影响一些基因的表达 • NADH/NAD+影响一些酶的活性

  46. 酶分子的改造 • 理性设计(rational design)与非理性设计(irrational design) • 酶的化学修饰 • 定点突变 • 易错PCR (error prone PCR) • DNA shuffling • 双功能酶

  47. 酶的化学修饰 • 对酶分子上的一些基团进行修饰，以改善酶的性质 • 可溶性大分子修饰 • 用对特定氨基酸残基作用的修饰剂与酶反应，以确定酶的活性中心 • Ser --- PMSF • Lys --- PLP • Trp --- NBS • His --- DEPC • Arg --- PGO • Glu/Asp --- CCMT

  48. 定点突变     葡萄糖异构酶 Gly138  Pro138， 最适温度提高10-12C

  49. 易错PCR (error prone PCR) 改变PCR的条件，使发生一定的碱基随机错配而引发多点突变 • 改变dNTP的比例 • 低保真度DNA聚合酶 • 增加离子浓度 枯草杆菌蛋白酶： 3点突变体活力提高38倍，10点突变体活力提高256倍

  50. DNA shuffling  靶基因随机突变  DNase 碎片化  碎片间互为模板与引物，重组PCR  PCR， 筛选出理想的突变 -内酰胺酶：活力提高270倍

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