芽孢杆菌分类鉴定及相关属的分类系统演变研究

1. 福建农林大学硕士毕业论文 芽孢杆菌分类鉴定及相关属的分类系统演变研究 姓 名：刘国红 导 师：林乃铨教授 刘 波研究员 2009年5月15日

2. 目 录 1 绪 论 2 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 3 芽孢杆菌的生物学特性 4 芽孢杆菌属相关属分类系统的演变 5 芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征 6 芽孢杆菌属已知种的信息整理 7 结论

3. 第 一 章 绪 论 • 1835年Ehrenberg发现并命名了枯草芽孢杆菌Vibrio subtilis。 • 1872年，Cohn根据细菌的形态特征命名了芽孢杆菌属(Bacillus)，并将枯草芽孢杆菌重命名为Bacillus subtilis。 • 随着分类研究技术的发展，尤其多相分类方法的应用，发现Bacillus内成员存在很大的差异。现在已有许多种从芽孢杆菌属中划分出来建立新属，有的甚至从芽孢杆菌科分出归属于别的科。 • 不同的文献来源，由于收集统计的时间、范围、内容、分类体系等的差异，所收集的芽孢杆菌种名数量不同。 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus

4. 第 一 章 绪 论 1.1芽孢杆菌的分类鉴定方法 1 经典鉴定分类法 2 化学分类法 醌组分分析 磷酸类脂分析 脂肪酸分析 3 分子分类法 G+C mol% DNA-DNA杂交 16S rDNA序列测序

5. 第 一 章 绪 论 1.2 芽孢杆菌的应用 芽孢杆菌包含许多特殊功能菌株，在工业、农业、医学等科学领域有重要研究作用，有着十分广泛的应用价值。 地衣芽孢杆菌 耐高温α-淀粉酶 嗜碱芽孢杆菌 碱性纤维素酶 苏云金芽孢杆菌 生物杀虫剂 枯草芽孢杆菌 活菌制剂 近10年中国芽孢杆菌研究文献增长动态

6. 第 一 章 绪 论 1.2 芽孢杆菌的生物多样性 • 芽孢杆菌在空气、土壤、污水等广泛存在，和人类生活有着极为密切的关系。 • 张华勇等用两种多样性指数研究了红壤中芽孢杆菌的分布 • 唐志燕等研究发现土成都郊区土壤中存在大量的芽孢杆菌，且芽孢杆菌属是土壤中的优势属

7. 第 一 章 绪 论 1.3 技术路线

8. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 1.1 材料 • 土样标本 15个省 • 芽孢杆菌菌株 分离到322株 1.2 研究方法 1.2.1 生理生化鉴定 试验方法是参照东秀珠等编的《常见细菌系统鉴定手册》。

9. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 1.2 研究方法 1.2.2 脂肪酸鉴定 脂肪酸提取方法主要参照MIDI操作手册。 快速振荡10 min，移出下层，洗涤，取上层。 获菌:约40mg 沸水浴5 min，取出振荡5-10 s，继续水浴25 min 精确控制(80±1) ℃水浴10 min

10. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 1.2 研究方法 1.2.3 部分芽孢杆菌菌株的ITS序列鉴定 1.2.3.1菌液制备菌煮沸5-7 min，反复冻融30 min2次即可。 1.2.3 .216–23 S rRNA之间 ITS的扩增引物 正向引物：5′-TCGCTAGTAATCGCGGATCAGC-3′； 反向引物： 5′-GCATATCGGTGTTAGTCCCGTCC-3′。 1.2.3.3 PCR扩增 95 ℃预变性45 s，94 ℃变性15 s，58 ℃ 复性30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环。 1.2.3.4 电泳 1.5%琼脂糖凝胶电泳 1.2.3.5 测序 1.2.3.6数据处理 Mega4.0进行聚类分析（Neighbour-Joining，pairwise deletion，Nucleotide: Jukes-Cantor）。

11. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.1芽孢杆菌的生理生化鉴定

12. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.1芽孢杆菌的生理生化鉴定 采用NTsys-2软件进行数值分类树状图，以0.76水平为界，322株芽孢杆菌可分为15个聚类群，具体如下： 第一群 包括109株菌株。不耐高温，耐碱但不耐盐，不能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。葡萄糖氧化型，接触酶、氧化酶阳性，蔗糖发酵大部分阳性，淀粉水解、硝酸盐还原反应、明胶液化阳性，吲哚反应阴性，M.R反应不定。 第二群 包括16株菌株。不耐高温，耐碱但不耐盐，大部分不利用丙二酸盐和柠檬酸盐。葡萄糖发酵型，接触酶阳性，氧化酶阳性，明胶液化阳性，蔗糖发酵、淀粉水解、M.R反应、V-P反应、硝酸盐还原反应、吲哚反应阴性。 第三群 包括11株菌株。不耐高温，耐碱，不耐盐，大多数不能利用丙二酸盐、柠檬酸盐，接触酶阴性，氧化酶不定，淀粉水解、吲哚反应阴性，硝酸盐还原、明胶液化阳性，葡萄糖发酵型或不利用，M.R、V-P反应不定。

13. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.1 芽孢杆菌的生理生化鉴定 第四群 包括17株菌株。耐高温，耐碱，耐盐，不能利用丙二酸盐，利用柠檬酸盐。葡萄糖氧化型或不利用，接触酶阳性，氧化酶大部分阳性，蔗糖发酵、M.R反应、明胶液化阳性，淀粉水解、吲哚反应阴性，硝酸盐还原反应不定。 第五群 包括1株菌株。生长温度5-55 ℃，耐高温，耐碱，不耐盐，能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。葡萄糖氧化型，接触酶阳性，氧化酶阴性，蔗糖发酵、M.R反应、V-P反应、明胶液化阳性，淀粉水解、硝酸盐还原反应、吲哚反应阴性。 第六群 包括6株菌株。耐高温，耐碱耐盐，大多能利用丙二酸盐。接触酶阳性，淀粉水解、V-P反应、硝酸盐还原、明胶液化阳性，吲哚反应阴性。 第七群 包括38株菌株。耐高温，耐碱耐盐，不能利用柠檬酸盐。葡萄糖发酵型，接触酶、氧化酶阳性，蔗糖发酵阳性，大部分淀粉水解阳性，吲哚反应阴性，硝酸盐还原不定。

14. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.1 芽孢杆菌的生理生化鉴定 第八群 包括4株菌株。生长温度大致为15-37 ℃，耐碱耐盐，能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。葡萄糖发酵型，接触酶、氧化酶、淀粉水解、M.R反应、V-P反应、硝酸盐还原反应、明胶液化阳性，吲哚反应阴性。 第九群 包括98株菌株。生长温度范围10-37 ℃，不耐高温，耐碱耐盐，大部分不能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。接触酶阳性，淀粉水解大部分阳性，硝酸盐还原、明胶液化阳性，吲哚反应阴性，氧化酶不定。 第十群 包括3株菌株。生长温度5-37 ℃，耐碱耐盐，pH 7.2-9.5，耐盐性2-7%，能利用丙二酸盐，不能利用柠檬酸盐。葡萄糖发酵型，蔗糖发酵阳性，硝酸盐还原阳性，淀粉水解、M.R反应、V-P反应、吲哚反应、明胶液化阴性。 第十一群 包括2株菌株。生长温度范围15-37 ℃，不耐高温，耐碱耐盐性，不能利用丙二酸盐，能利用柠檬酸盐。葡萄糖氧化型，接触酶阳性，V-P反应、吲哚反应、明胶液化阳性，M.R反应、硝酸盐还原阴性。

15. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.1 芽孢杆菌的生理生化鉴定 第十二群 包括7株菌株。生长温度10-37 ℃，不耐高温，耐碱不耐盐，大多不能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。葡萄糖发酵型，接触酶阳性，淀粉水解、硝酸盐还原反应、吲哚反应阳性，氧化酶阴性，V-P反应阴性，M.R反应不定，明胶液化不定。 第十三群 包括1株菌株。生长温度范围15-37 ℃，不耐高温，耐碱不耐盐，在2%NaCl时能生长，能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。接触酶阳性，硝酸盐还原、吲哚反应阳性，氧化酶阴性，蔗糖发酵、淀粉水解、M.R反应、V-P反应、明胶液化阴性。 第十四群 包括3株菌株。不耐高温，耐碱不耐盐，2%NaCl条件下不生长，不能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。氧化酶、接触酶阳性，蔗糖发酵、M.R反应、明胶液化阳性，吲哚反应、V-P反应、硝酸还原反应、淀粉水解阴性。 第十五群 包括3株菌株。不耐高温，耐碱不耐盐，不能利用丙二酸盐和柠檬酸盐。葡萄糖发酵型，接触酶、氧化酶阳性，M.R反应、V-P反应、明胶液化、吲哚反应阳性，硝酸盐还原反应、淀粉水解阴性。

16. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.2 脂肪酸鉴定 根据MIDI操作手册上的匹配原则，共有132株未知芽孢杆菌鉴定到种。其中，枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus atrophaeus有16株，短小芽孢杆菌Bacillus pumilus有8株，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis有4株，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus有22株，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa有4株，巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium有53株，简单芽孢杆菌Bacillus simplex有1株，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有8株，球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus有6株，覃状芽孢杆菌Bacillus mycoides有10株。

17. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.3 部分芽孢杆菌菌株的ITS序列鉴定 ITS测序结果表明： 菌株4470和枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus atrophaeus具有很高的相似度，菌株4500和4502与短小芽孢杆菌Bacillus pumilus有很高的相似性，4480和4385与球形芽孢杆菌Bacillus sphaerius有很高的相似性，4396和4469与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium有很高的相似性，菌株4521和简单芽孢杆菌Bacillus simplex亲缘关系很近。

18. 第二章 芽孢杆菌的分离、保存与鉴定 2 结果与分析 2.4 芽孢杆菌脂肪酸鉴定和ITS测序结果的比较 11株菌的脂肪酸鉴定结果和ITS测序比对结果大部分一致，菌株4470的脂肪酸鉴定结果和ITS测序结果不同，脂肪酸的鉴定结果为枯草芽孢杆菌黑色变种，ITS测序结果为枯草芽孢杆菌，脂肪酸鉴定结果在种水平上算是准确的。

19. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 1 研究方法 1.1 芽孢杆菌的形态特征 电镜下观察简单芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的细胞形态，芽孢形状、生长位置等。NA培养基上培养2 d左右，肉眼观察平板上菌落的形态，如颜色、形状、大小、质地、边缘等。 1.2 芽孢杆菌的生长特性 以7株枯草芽孢杆菌为例说明芽孢杆菌的生长特性。温度梯度培养 测定温度（℃）有5，10，15，30，37，50，55，pH梯度有4.5，5.7，7.2，8.0，9.5，耐盐 NA培养基中加入不同浓度的NaCl（2%、5%、7%、10%），取幼龄枯草芽孢杆菌菌株划线培养，设3个重复，培养3和7 d，目测生长情况。

20. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 1 研究方法 1.3 芽孢杆菌的生态分布 应用物种丰富度指数(S)，物种多样性指数(H′)，均匀度指数(E)，生态优势度(D)，以及分离频度计算芽孢杆菌的物种多样性。计算公式如下： S＝Ni，H′＝-∑pi㏑pi，E＝H′/Hmax，D＝∑(pi)2. Ni为每个样点所分离不同种的数量，pi为是第i种的多度比例，pi＝ni/N，ni是第i种的菌株数，N=∑ni，Hmax＝㏑S。 1.4 芽孢杆菌生防菌筛选 香蕉枯萎病病原菌生防菌筛选PDA平板对峙法，3-5 d观察结果。 青枯雷尔氏菌生防菌筛选平板稀释法，将青枯雷尔氏菌1020菌液与100 mL CPG培养基混匀，倒板。待测菌划线培养于上述平板，3 d观察结果。

21. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.1 芽孢杆菌的形态特征 a-d为简单芽孢杆菌Bacillus simplex的细胞形态：a为没有形成芽孢时的细胞形态，b-d则为产生芽孢后的形态，从图片中可以看出简单芽孢杆菌的芽孢中生，柱状或椭圆形。图片e为类芽孢杆菌Bacillus polymyxa的细胞形态：细胞小，短杆状，芽孢中生，近卵圆形。图片f为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的细胞形态：细胞长杆状，芽孢中生，柱状。

22. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.1 芽孢杆菌的形态特征 芽孢杆菌菌落形态根据种不同而不同，以下描述了几种常见芽孢杆菌的菌落形态：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis白色或浊白色，扁平，干燥，无光泽，表面的层膜状物形成褶皱，有的菌落中间有“水珠”，还有一株芽孢杆菌的菌落形态和其他完全不同，浅黄色，突起，近圆形，光泽，湿润。巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 黄色，湿润，光滑，不透明，粗壮，具有流动性，有的菌落表面微皱，菌落培养久时会产生黑色素。蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus白色，扁平，圆形，边缘不整齐，有的布满整个平板，和覃状芽孢杆菌的菌落形态相似。球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus浅黄色，圆形，有光泽，不透明，有时连成一片布满整个平板。多粘类芽孢杆菌Bacillus polymyxa菌落小，米粒状，紧贴培养基，粘，不易挑取。短小芽孢杆菌Bacillus pumilus黄色，湿润，边缘不整齐，突起。

23. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.2 芽孢杆菌的生长特性 枯草芽孢杆菌的最高生长温度为55 ℃，最低生长温度为10 ℃ 碱性条件或弱酸性条件对枯草芽孢杆菌的生长影响不大 随着盐浓度的增大，7株枯草芽孢杆菌的生长速率逐渐减小，菌落数量也减少。

24. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.3 芽孢杆菌的生态分布 我国芽孢杆菌的种群数量

25. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.3 芽孢杆菌的生态分布 我国芽孢杆菌的种群数量

26. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.3 芽孢杆菌的生态分布 我国芽孢杆菌种群的多样性 15个分离到的采样点芽孢杆菌的丰富度在2- 8种之间。青海采样点的分离到的种群最少，只分离到2种，新疆、内蒙古和宁夏的芽孢杆菌丰富度最高，为8。

27. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.3 芽孢杆菌的生态分布 我国芽孢杆菌种群的多样性 三种生境类型的多样性指数比较为：林地>旱地>草地。

28. 第三章 芽孢杆菌的生物学特性 2 结果与分析 2.4 芽孢杆菌生防菌的筛选 对香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用的芽孢杆菌 已筛选到 22 株芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌4株，枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus atrophaeus、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、简单芽孢杆菌Bacillus simplex各3株，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa 9株。

29. 对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的芽孢杆菌 已筛选到 15 株芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus atrophaeus有1株，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 1株，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus 1株，巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 5株，简单芽孢杆菌Bacillus simplex 3株，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa 2株，覃状芽孢杆菌Bacillusmycoides 2株。

30. 第四章 芽孢杆菌属相关属分类系统的演变 1 材料与方法 参考《伯杰氏系统细菌学手册》第二版和《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版。 2 结果与分析 《伯杰氏细菌鉴定手册》(Bergey‘s Manual of Determinative Bacteriology)第八版中芽孢杆菌的分类概况

31. 第四章 芽孢杆菌属相关属分类系统的演变 2 结果与分析 《伯杰氏系统细菌学手册》第二版中芽孢杆菌属及相关属的分类概况。

32. 第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征 1 材料与方法 参考《伯杰氏系统细菌学手册》第二版和IJSEM上发表的文章 2 结果与分析 本文主要根据《伯杰氏系统细菌学手册》第二版收录的芽孢杆菌相关属和在IJSEM上发表的文章，讲述芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征。主要根据细胞形状、芽孢形状、孢囊、需氧性、接触酶、硝酸还原、10%NaCl、最佳pH、最佳温度、肽聚糖类型、主要异戊二烯醌类、脂肪酸类型、G+C mol%等指标讲述芽孢杆菌相关属模式种的主要特征。

33. 第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征 2 结果与分析 形态 生理生化 化学法 分子 模式种

34. 第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征 2 结果与分析 形态 生理生化 化学法 分子 模式种

35. 第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征第五章芽孢杆菌相关属的分类依据及模式种的主要特征 2 结果与分析 形态 生理生化 化学法 分子 模式种

36. 第六章芽孢杆菌属已知种的信息整理 1 材料与方法 本章参考文献来自于IJSEM上从1951年至2008年12月发表的关于芽孢杆菌属已知种的文章。 2 结果与分析 根据2008年12月份为止，IJSEM上收录的芽孢杆菌种有112种。

37. 第 七 章 总 结 • 通过形态特征、生理生化特征、脂肪酸成分、ITS测序等手段，322株芽孢杆菌鉴定为芽孢杆菌属11个种：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌黑色变种Bacillus atrophaeus，巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus，多粘类芽孢杆菌Bacillus polymyxa，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，覃状芽孢杆菌Bacillus mycoides，简单芽孢杆菌Bacillussimplex；类芽孢杆菌属Panebacillus 2个种；短短芽孢杆菌属Brevibacillus 2个种。 • 根据特征脂肪酸能快速将未知菌鉴定到种，但不一定十分准确。可分两种情况判断结果：一是菌株脂肪酸完全提取。脂肪酸鉴定结果以第一匹配值为准，且第一匹配值与第二匹配值要相差0.1以上。二是菌株脂肪酸没有完全被提取。若鉴定结果只有一个匹配值并SI在0.4以上，鉴定结果准确；若鉴定结果有两个或两个以上，且结果为同一个种，SI指数在0.3以上，鉴定结果准确。 3 不同种的芽孢杆菌菌落形态不一样，同一种不同菌株的菌落也不同。通过电镜观察，芽孢杆菌细胞杆状，一个细胞产生一个芽孢，芽孢的形状为椭圆形或柱状。

38. 第 七 章 总结 4 温度、NaCl浓度对7株枯草芽孢杆菌的生长影响不同。菌株4465，4580耐热，能在55 ℃生长，菌株4481，4428，4580，4581能在10% NaCl下生长。pH对枯草芽孢杆菌的生长影响不大。 5 我国每个省的土壤中都存在丰富的芽孢杆菌种类，在每个采样点都能分离到巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium。我国土壤中主要巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，多粘类芽孢杆菌Bacillus polymyxa，简单芽孢杆菌Bacillus simplex为主。 6 本文初步研究芽孢杆菌对青枯雷尔氏菌和香蕉枯萎病病原菌的拮抗作用，筛选到对香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用的芽孢杆菌有22株，对青枯雷尔氏菌有拮抗作用的有15株。 7 根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《伯杰氏系统细菌学手册》第二版，讲述了芽孢杆菌相关属的分类系统及其分类依据和模式种的特征。并根据IJSEM上发表的文章，整理了112个芽孢杆菌种的特征、16S rRNA序列号和标准菌株编号。

39. 谢谢