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第二章 蛋白质的结构与功能 Chapter 2 Structure and Function of Protein

第二章 蛋白质的结构与功能 Chapter 2 Structure and Function of Protein. 主讲人：段江燕. 蛋白质 (protein) 是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。. 第一节 蛋白质通论. 蛋白质的组成与分类 蛋白质的大小与分子量 蛋白质的构象 蛋白质的功能. 第二节 蛋白质的组成－氨基酸. 组成蛋白质的基本单位是氨基酸。 天然的蛋白质完全水解，最后都可得到约二十种不同的氨基酸。除 脯氨酸 和 甘氨酸 外，其余均属于 L-α- 氨基酸 。 氨基酸的功能 （ 1 ）、组成蛋白质

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第二章 蛋白质的结构与功能 Chapter 2 Structure and Function of Protein

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  1. 第二章 蛋白质的结构与功能Chapter 2 Structure and Function of Protein 主讲人：段江燕

  2. 蛋白质(protein)是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。蛋白质(protein)是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。

  3. 第一节 蛋白质通论 • 蛋白质的组成与分类 • 蛋白质的大小与分子量 • 蛋白质的构象 • 蛋白质的功能

  4. 第二节 蛋白质的组成－氨基酸 • 组成蛋白质的基本单位是氨基酸。 • 天然的蛋白质完全水解，最后都可得到约二十种不同的氨基酸。除脯氨酸和甘氨酸外，其余均属于L-α-氨基酸。 • 氨基酸的功能 （1）、组成蛋白质 （2）、一些aa及其衍生物充当化学信号分子 -氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羟色胺、褪黑激素，都是神经递质，甲状腺素（Tyr衍生物） ，吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素 （3）、氨基酸是许多含N分子的前体物 核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa （4）、一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物 精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸)尿素循环的中间物，

  5. 一、氨基酸(amino acid)的结构与通式

  6. 基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，20种，基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，20种， 稀有氨基酸：是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。 非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质 (约150种)。

  7. 二、基本氨基酸的分类： • 根据R侧链基团性质的不同，可将氨基酸进行分类 • 杂环氨基酸、芳香族氨基酸与脂肪族氨基酸 • 极性氨基酸与非极性氨基酸

  8. 1、按照R基的化学结构分类 （1）、R为脂肪烃基的氨基酸（5种）

  9. （2）、R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）

  10. （3）、R中含有酰胺基团（2种）

  11. （4）、R中含有酸性基团（2种）

  12. （5）、R中含碱性基团（3种）

  13. （6）、 芳香族氨基酸

  14. （7）、杂环族氨基酸（1种）

  15. 2、极性分类可分为： • 非极性氨基酸：Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe,Try,Met。 • 极性氨基酸：Gly,Tyr，Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；Lys,Arg,His;Asp,Glu.

  16. 三、氨基酸的理化性质： 1．两性解离及等电点： (1) 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在 ①晶体溶点高 → 离子晶格，不是分子晶格。 ②不溶于非极性溶剂 →极性分子 ③介电常数高→ 水溶液中的氨基酸是极性分子。 (2) 氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线 HA → A- + H+ pH=pKa/ +Log[A-]／[HA] • pKa/ 就是HA50%解离（[碱] = [酸]）时溶液的pH值，Ka/就是此时溶液的[H+] • 当HA50%解离时，溶液的pH值等于pKa/ • pH = pKa/ 时，[碱] = [酸]（50%解离） pH > pKa/ 时，[碱] > [酸]（＞50%解离） pH < pKa/ 时， [酸] > [碱]（＜50%解离）

  17. 氨基酸分子是一种两性电解质。 • 通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变。 • 氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。

  18. 2．紫外吸收性质： • 组成天然蛋白质分子的20种氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。 • 可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。

  19. 氨基酸的光吸收性 Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm近紫外区有吸收。 λ（nm） ε Tyr 275 1.4×103 Phe 257 2.0×102 Trp 280 5.6×103

  20. 3．氨基酸的化学反应 （1）氨基参与的反应 • 与亚硝酸反应（Van Slyke 法测定氨基酸） • Sanger 反应 ：2.4一二硝基氟苯（DNFB） • Edman反应：苯异硫氰酸酯，PITC • 生成西佛碱的反应（Schiff）：西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。 • 甲醛反应

  21. （2）羧基参与的反应 1、成盐、成酯反应 2、成酰氯的反应 氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯， 使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。 3、叠氮反应 ：活化羧基，可用于肽的人工合成 4、脱羧基反应：Glu脱羧形成γ-氨基丁酸

  22. （3）α-NH2和α-COOH共同参加的反应 • 与茚三酮反应茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（λmax=570nm）。Pro、Hy-Pro与直接形成黄色化合物（ λmax=440nm） • 成肽反应

  23. （4）侧链R基参加的反应——用于蛋白质的化学修饰（4）侧链R基参加的反应——用于蛋白质的化学修饰 • Trp • Arg • His • Tyr • Cys • Pro

  24. 三、氨基酸的分离和分析 （一）基于电荷性质差异的分离方法 1、电泳分离 电泳的基本原理 Glu、Leu 、His 、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度： Glu Leu His Lys pI 3.22 5.98 7.59 9.74 2、离子交换柱层析

  25. （二）基于分配系数（极性）差异的分离方法——分配层析（二）基于分配系数（极性）差异的分离方法——分配层析 • 1、 纸层析 • 2、薄层层析 • 3、分配柱层析

  26. 第三节 蛋白质的分子结构 • 蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。 • 蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构，即构象。 • 构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。

  27. 一、一级结构 （一）氨基酸的连接方式 1、肽键 2、二硫键 3、铰链 4、异肽键 • 蛋白质是由若干氨基酸的氨基与羧基经脱水缩合而连接起来形成的长链化合物。一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基在适当的条件下经脱水缩合即生成肽。

  28. 两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。 • 多肽链具有方向性，头端为氨基端（N端），尾端为羧基端（C端）。 • 凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。

  29. 谷胱甘肽（GSH）： • 全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。

  30. 谷胱甘肽的生理功用： • 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； • 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； • 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； • 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

  31. （二）一级结构的测序

  32. 1、测序的一般步骤 （1）测定蛋白质分子中多肽链的数目 （2）拆分蛋白质分子中的多肽链。 （3）断裂链内二硫键。 （4） 分析多肽链的N末端和C末端。 （5）测定多肽链的氨基酸组成。 （6）多肽链部分裂解成肽段。 （7）测定各个肽段的氨基酸顺序 （8）确定肽段在多肽链中的顺序。 （9）确定多肽链中二硫键的位置。

  33. 2、   端基分析 ①N端分析 ★DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。 ★DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等 ★ PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。

  34. ②C端分析 ★肼解法 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。 Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。 ★羧肽酶法（Pro不能测） 羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B：只水解Arg、Lys N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C

  35. 3、肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 （1）、   化学裂解法 ①溴化氰 —Met—X— 产率85% ②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率70-100% ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys— ④羟胺NH2OH —Asn—Gly— 约150个氨基酸出现一次

  36. （2）、   酶法裂解 ①胰蛋白酶 Lys X (X ≠ Pro) Arg—— X  ②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X (X ≠ Pro) Trp——X Phe——X 胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu) ③Glu蛋白酶 Glu——X （Vs蛋白酶） ④Arg蛋白酶 Arg——X ⑤Lys蛋白酶 X——Lys ⑥Pro蛋白酶 Pro——X

  37. （4）二硫键的确定（对角线电泳法） 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽，测序 与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。

  38. （三）蛋白质的一级结构与生物功能 ★蛋白质的一级结构决定高级结构和功能

  39. ★同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化 通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。 亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。 同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。 如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。

  40. ★蛋白质一级结构的突变—分子病 分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。 镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val ★一级结构的部分切除与蛋白质的激活

  41. 二、二级结构（一）、蛋白质分子中的非共价键(次级键)二、二级结构（一）、蛋白质分子中的非共价键(次级键) 1. 氢键： • 氢键(hydrogen bond)的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间。 • 氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用。 • 氢键的键能较低(~12kJ/mol)，因而易被破坏。

  42. 蛋白质分子中氢键的形成

  43. 2. 疏水键： • 非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。 • 蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。

  44. 3. 离子键（盐键）： • 离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。 • 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。

  45. 蛋白质分子中离子键的形成

  46. 4．范德华氏（van der Waals)引力： • 原子之间存在的相互作用力。

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