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单克隆抗体制备技术

单克隆抗体制备技术. 广州医学院检验系 徐霞. 基本概念. 抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体. Antigenic determinant. 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位( epitope). 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团. Polyclonal antibody,PcAb： 针对多种抗原决定簇的混合抗体 Monoclonal antibody,McAb: 由单个 B 细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体.

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单克隆抗体制备技术

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Presentation Transcript

  1. 单克隆抗体制备技术 广州医学院检验系 徐霞

  2. 基本概念 • 抗原决定镞（抗原表位） • 细胞克隆 • 多克隆抗体 • 单克隆抗体

  3. Antigenic determinant • 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).

  4. 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团

  5. Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体 • Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体

  6. 杂交瘤技术的理论基础 • 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 • 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 • 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb

  7. 当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。

  8. 细胞DNA合成途经 1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （A-） 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）

  9. HAT选择培养基的原理 • HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)

  10. 抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞） （B细胞恶性肿瘤） 1. 抗体分泌（Ig+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2.8-AG筛选出HGPRT-株PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）

  11. 融合的结果及命运 杂交瘤细胞 未融合的骨髓瘤细胞 脾-脾杂交细胞 未融合的脾细胞 骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞

  12. 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定

  13. 制备单克隆抗体的基本技术 1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化

  14. 免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。 • 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行） • 选用6-12周龄Balb/c小鼠　

  15. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 • 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 • 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

  16. 骨髓瘤细胞系选择要点： • 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 • 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 • 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） • 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％ • 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 • 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 • 饲养细胞一般在融合前一天制备

  17. 免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。 • 融合比例： • 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 • 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） • 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液

  18. 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。 • 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。

  19. 克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。 • 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 • 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法 • 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染

  20. 单抗生产的方法： • 动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。

  21. 单抗纯化方法： • 盐析 • 凝胶过滤 • 离子交换层析 • 亲和层析法 • 辛酸沉淀法

  22. 单克隆抗体特性 • 理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备

  23. 单克隆抗体在医学中的应用 • 检验医学诊断试剂 • （1）病原微生物抗原抗体的检测 • （2）肿瘤抗原的检测 • （3）免疫细胞及其亚群的检测 • （4）激素测定 • （5）细胞因子的测定 • 蛋白质的提纯 • 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术

  24. 基因工程抗体与抗体库技术 • 单抗体内应用和疗效受限原因： • 1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 • 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少 • 3.生产成本高,难于普及应用

  25. 人杂交瘤技术未获真正突破原因: • 融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫 • 基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。 • 抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。

  26. 临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物—人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的检测项目，现提供给你重组cTnI抗原，请你设计可行性实验方案。临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物—人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的检测项目，现提供给你重组cTnI抗原，请你设计可行性实验方案。

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