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第二十一章

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第二十一章. 常用免疫学相关实验技术及方法. 第一节 免疫学方法概论. 一、免疫学方法的发展史 1796 年: Jenner 发明了接种牛痘方法预防天花 2 个世纪后被广泛接受 1979 年 WHO 宣布天花灭迹 19 世纪末期: koch 发现病原体是感染性疾病病因 促进了实验免疫学的发展. 19 世纪 80 年代: Pasteur 预防鸡霍乱的疫苗 狂犬病疫苗 1888 : Behring 发现了抗体

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第二十一章

常用免疫学相关实验技术及方法

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第一节 免疫学方法概论

一、免疫学方法的发展史

1796年:Jenner发明了接种牛痘方法预防天花

2个世纪后被广泛接受

1979年 WHO宣布天花灭迹

19世纪末期:koch发现病原体是感染性疾病病因

促进了实验免疫学的发展

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19世纪80年代:Pasteur 预防鸡霍乱的疫苗

狂犬病疫苗

1888:Behring发现了抗体

Methchnikoff发现了巨噬细胞

20世纪初:发现了调理素,体液因素可影响吞噬细胞功能

1900-1930:认识了过敏反应,发现了血清病

Arthus反应,皮肤反应

调理作用,补体结合反应

疫苗研究有了新发展:BCG--结核

白喉毒素--白喉

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1935-1957:抗体纯化,鉴定及测定技术

凝胶内沉淀技术,抗原抗体

免疫电泳等血清血技术

1959-1974:放射标记免疫技术、酶标免疫技术

生物素-亲和素标记免疫技术

荧光标记免疫技术、金(银)标记免疫等技术

化学发光免疫技术、免疫分子转染技术

细胞和细胞因子测定技术

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20世纪70年代后期:免疫及分子生物学技术发展成熟20世纪70年代后期:免疫及分子生物学技术发展成熟

单克隆抗体问世,组织相容性抗原

B细胞免疫球蛋白基因重组,T细胞受体

1980:PCR技术

生物芯片技术

转基因动物技术

slide6
免疫学方法就是通过实验证实机体免疫反应的过程免疫学方法就是通过实验证实机体免疫反应的过程

基本参与单位有:抗原

抗体

免疫细胞和免疫分子

slide7

第二节 体液免疫学方法

一、抗原制备

1. 天然抗原制备

(1)粗抗原的提取:冻融法、冷热交替法、超声法

(2)粗抗原纯化:

选择性沉淀法:盐析沉淀法、核酸沉淀法

凝胶过滤和离子交换层析

亲和层析法

蛋白电泳

2 tea bag method
2. 合成抗原制备

化学合成高分子氨基酸聚合物,即多肽

合成肽与载体蛋白连接后能有效诱导抗体产生免疫应答

常用方法:tea bag method

纯化方法:反向高效液相色谱法

1 polyclonal antibody
二、抗体制备

1. 多克隆抗体(polyclonal antibody)制备

在自然免疫或免疫动物后产生的具有不同特异性和亲和性的多种抗体混合分子

具有抗多种不同抗原的表位

2 monoclonal antibody b b
2. 单克隆抗体(monoclonal antibody)制备

由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体

产生方法:B细胞克隆与小鼠骨髓瘤细胞融合产生

的杂交瘤细胞

3 engineer antibody
3. 基因工程抗体 (engineer antibody)

应用抗体库技术产生

将某种动物所有抗体的可变区基因克隆到质粒或噬菌体中并表达

利用不同抗原筛选出携带特异抗体的基因克隆,从而获得特异性抗体

elisa
三、抗体的应用及其相应的免疫学技术

(一) 酶联免疫吸附测定(ELISA)

基本原理是利用酶标记抗体或抗原,使之成为酶标抗体(或抗原)

抗原或抗体固定到固相载体表面并保持其免疫活性

利用抗原、抗体复合物的免疫学反应原理来测定未记标的抗原(或抗体)

slide13

(二)放射免疫测定(radioimmunoassay)

用于测定组织液和血液中的激素水平

在固相载体中标记的特异性抗体(125I来标记)与特定的未标记抗原产生特异性免疫结合

非特异性吸附可以通过加入过量的非特异性卵磷脂蛋白或洗涤液来封闭

特异性结合的抗原、抗体复合物残留在反应板或试管中,其放射性强度可以直接测定

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(三)免疫荧光技术(immunofluorescence technology)

原理是将荧光色素与特异性抗体(或抗原)以化学的方式结合起来,但不影响该血清抗体的免疫特性

将荧光标记抗体在特定的条件下浸染标本,使之与标本中相应的抗原产生结合反应

反应的结果——产生含有荧光标记的抗原、抗体结合物,可用荧光显微镜观察

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(四)免疫组织化学技术(immunohistochemistry)

检测组织切片中蛋白分子在细胞中分布的方法

用化学的方法将酶与抗体结合起来,将标记的抗体与组织切片中的抗原产生特异性的结合

结合后的抗原、抗体复合物中含有的酶可将再加入的无色酶底物通过化学反应呈色,借助显微镜检测各种抗原物质

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(五)免疫印迹技术(immunoblot ,Western blot)

基本过程是将蛋白质样品在凝胶电泳中分离

通过电转染将已分离的蛋白分子转移到固相膜上

在固相膜上用标记(放射标记或酶标记)的特异性抗体检测蛋白质抗原

免疫印迹技术结合了凝胶电泳分辩力高和固相免疫测定敏感、简便、稳定等优点

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A

0 5 10 20 30 60 120 min

OSCC

Tca8113

Tb

Tca8113-M

OSC-4

B

OSCC

Tca8113

Tb

Tca8113-M

OSC-4

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(六)免疫电泳技术

是电泳分析与沉淀反应的结合产物

这种技术有两大优点,一是加快了沉淀反应速度,二是将一些蛋白质组分利用其电荷的不同将其分开

分别与抗体反应,以其沉淀线的最高稀释度为抗体的效价

1. 免疫电泳 2. 对流免疫电泳

3. 火箭免疫电泳 4. 免疫固定电泳

5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

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第三节 细胞免疫学技术

一、白细胞的分离

血液中红细胞与白细胞比例为600:1~1000:1

两者的比重不同,其沉降速度亦异

通常用两种方法加以分离。

1. 自然沉降法

2. 聚合物加速沉降法

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二、外周血单个核细胞的分离

包括淋巴细胞和单核细胞,其体积、形态和密度与其它细胞不同,红细胞和多核白细胞密度较大,为1.09左右,而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075-1.090,血小板为1.030-1.035

利用一种密度介于1.075-1.092之间而近于等渗透的溶液(分层液)做密度梯度离心,使细胞按相应密度梯度分布,将各种血细胞加以分离

常用的方法有Ficoll和Percoll两种

slide21
三、淋巴细胞及其亚群的分离

纯淋巴细胞的采集

黏附贴壁法

磁铁吸引法

slide22
四、淋巴细胞亚群的分离

E花环沉降法

尼龙毛分离法

亲和板结合分离法

流式细胞分选法

t t 1 2
五、淋巴细胞的功能分析

(一)T细胞功能的检测

T细胞转化试验

(1)非抗原性刺激物

(2)抗原性刺激物

2 1 2
2. 细胞杀伤试验

(1)形态学检查法

(2)放射性核素法

b b b
(二)B细胞功能的检测

B细胞早期活性指标的测定

溶血空斑形成试验

B细胞增殖能力试验

slide26
(三)NK细胞能力的检测

形态法

酶释法

荧光法

放射性

化学发光法

1 2 2 1 2 3
(四)吞噬细胞的检测

中性粒细胞功能的检测

(1)细胞运动功能检测

(2)吞噬和杀菌功能的检测

2. 巨噬细胞功能的检测

(1)炭粒廓清试验

(2)吞噬功能的检测

(3)巨噬细胞溶酶体酶的测定