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第 五 章

第 五 章. 转录及转录后加工. 生化教研室 肖建英. 主要内容：. 第一节 转录的基本原理 第二节 DNA 指导下的 RNA 聚合酶 第三节 与转录起始和终止有关的 DNA 结构 第四节 转录后加工过程及其机制. RNA. DNA. 第一节 转录的基本原理. 一、基本概念. 转录 (transcription) 生物体以 DNA 为模板合成 RNA 的过程 。. 转录. 参与转录的物质. 原料 : NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板 : DNA

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  1. 第 五 章 转录及转录后加工 生化教研室 肖建英

  2. 主要内容： 第一节 转录的基本原理 第二节 DNA指导下的RNA聚合酶 第三节 与转录起始和终止有关的DNA结构 第四节 转录后加工过程及其机制

  3. RNA DNA 第一节 转录的基本原理 一、基本概念 转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程。 转录

  4. 参与转录的物质 原料:NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA 酶:RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子

  5. 二、转录与复制的异同 • 转录与复制的相似之处： ⑴ 都是酶促的核苷酸聚合过程； ⑵ 都以DNA为模板； ⑶ 都需依赖DNA的聚合酶； ⑷ 聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键； ⑸ 都从5′至3 ′方向延伸成新链多聚核苷酸； ⑹ 都遵从碱基配对规律—— 但转录忠实性要低于DNA复制。 ⑺ 转录与复制都受到严格的调控

  6. 转录和复制的区别 引物 有 无 高度进行性 中途不停止 可一段一段复制

  7. 第二节 DNA指导下的RNA聚合酶 一、原核生物的RNA聚合酶 大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶是由4种亚基α、β、β´和σ (sigma)组成的五聚体蛋白质， 分子量为480kD。 α2ββ´合称为核心酶(core enzyme)； 在试管内能催化NTP聚合生成RNA。 σ亚基加上核心酶(α2ββ´σ)称为全酶（holoenzyme)。

  8. RNA聚合酶—— 大肠杆菌RNA聚合酶组分

  9.          RNA聚合酶—— 核心酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme)

  10. RNA聚合酶—— RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合

  11. RNA聚合酶—— 二、真核生物的RNA聚合酶 真核生物的RNA聚合酶 种类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 定 位 核 仁 核 质 核 质 转录产物 45s-rRNA hnRNA 5s-rRNA,tRNA, U1-13snRNA U6snRNA， （U6除外） 非UsnRNA 对鹅膏蕈碱反应 耐受 极敏感 中度敏感

  12. 转录模板 • DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。 • DNA双链按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作反意义链或Watson链。 • 相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为有意义链或Crick链。

  13. 5´……G C A G T A C A TG T C……3´ 3´…… c g t c a t g t a c a g……5´ 编码链 ｝ DNA 模板链 转录 mRNA 5´……G C A G UA C A UG UC……3´ 翻译 肽 N …… Ala · Val · His · Val ……C DNA模板、转录产物mRNA 和氨基酸序列之间的关系

  14. 转录方向 转录方向 结构基因 5 3 3 5 编码链 模板链 模板链 编码链

  15. 不对称转录(asymmetric transcription) • 在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ； • 模板链并非永远在同一条单链上。

  16. 第三节 与转录起始和终止有关的DNA结构 一、原核生物的启动子和终止子 （一）启动子结构 原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。

  17. 调控序列 结构基因 53 35 RNA-pol RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。

  18. RNA聚合酶保护法

  19. RNA聚合酶保护区 结构基因 3 5 5  3  3  5  3 5 -50 -40 -30 -20 -10 1 10 开始转录 -35 区 -10 区 T T G A C A A A C T G T T A T A A T Pu A T A T T A Py RNA-pol辨认位点 (recognition site) (Pribnow box) 原核生物启动子保守序列

  20. -35区 -10区 +1 trp T T G A C A…N17…T T A A C T · N7 · A… tRNAtrp T T T A C A…N16… T A T G A T · N7 · A… Lac T T T A C A…N17…T A T G T T · N6 · A… recA T T G A T A…N16…T A T A A T · N7 · A… ara C T G A C G…N18…T A C T G T · N6 · A… 最大一致性T T G A C A T A T A A T 38 36 29 40 25 30 37 37 28 41 29 44 X/45 被RNA聚合酶保护的DNA区段碱基序列分析

  21. 细菌中常见两种启动子突变： 启动子上升突变，提高转录活性； 启动子下降突变，降低转录水平。 1、Pribnow 框： －10区，保守序列为 TATAAT。 Pribnow 框是RNA聚合酶的牢固结合位点， 简称结合位点。 • σ的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启 动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。

  22. 2、Sextama 框： －35区，保守序列为TTGACA。 Sextama 框是RNA聚合酶中 σ的识别位点， 也是RNA聚合酶的初始结合位点。 • Pribnow 框与Sextama 框之间的碱基序列 并不重要，但两个序列之间的距离十分重要； • 天然启动子这段距离多为15～20bp，距离的 • 大小可能是决定启动子强度的因素之一。 • 实验表明：两个序列之间的距离为17bp时， • 转录效率最高。

  23. 3、CAP位点：（乳糖操纵子的启动子序列） • CAP即分解代谢物基因激活蛋白 (catabolite gene activation Protein) 也称环腺苷酸受体蛋白（CRP）。 • CAP分子内有两个结构域： • 羧基末端结构域是DNA结合区； • 氨基末端结构域是cAMP结合位点。 • CAP与cAMP的结合能提高CAP对双链DNA 的亲和力； • CAP与启动子（CAP位点）的结合是激活乳 糖操纵子转录的必要条件。

  24. AATGTGAGTT AGCTCACTCA TTACACTCAATCGAGTGAGT 位点Ⅰ的反向重复序列 • 乳糖启动子中有两个CAP结合位点： • 一个在 －70 ～ －50位点，称位点Ⅰ； • 一个在 －50 ～ －40位点，称位点Ⅱ。 • 位点Ⅰ包含一个反向重复序列，是强结合位点； • 位点Ⅱ是弱结合位点。

  25. （二）终止子结构 提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）。 终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。 • 原核生物终止子分为两类： • 一类是不依赖于ρ因子的转录终止； • 一类是依赖ρ因子的转录终止； • 两类终止子有共同的序列特征： • 在转录终止点之前有一段间断的回文结构。 • 两类终止子碱基组成的不同点： • 不依赖ρ因子 回文结构富含G-C 下游富含A-T • 依赖ρ因子 G-C含量较少 下游无特征

  26. 不依赖ρ因子 的终止子 CGCCCGA GCGGGCU 5´ 转录方向 模板链 5´ 3´ TCGGGCG AGCCCGC CGCCCGA GCGGGCT AAAAAA TTT TTT DNA 5´ 编码链 3´ 模板链 5´ 3´ AAAAAA UUUUUU DNA 3´ 5´ 编码链 3´ TTTTTT 转录产物

  27. 依赖ρ因子 的终止子 CUACUUA GAUGAAU 5´ 转录方向 模板链 5´ 3´ TAAGTAG ATTCATC CTACTTA GATGAAT AGCTAC TCGATG DNA 5´ 编码链 3´ 模板链 5´ 3´ AGCTAC UCGAUG DNA 3´ 5´ 编码链 3´ TCGATG 转录产物

  28. 二、真核生物的启动子 真核生物的三种RNA聚合酶，每一种都有自己 的启动子类型。 （一）RNA聚合酶Ⅰ的启动子 即 rRNA 基因的启动子，称Ⅰ类启动子。 • Ⅰ类启动子分两部分： • －40 ～ ＋5 称为近启动子，决定转录起始的位点； • －165～－40 称为远启动子，影响转录的频率。

  29. （二）RNA聚合酶Ⅱ的启动子 即 mRNA基因的启动子，称Ⅱ类启动子 1、帽子位点（cap site）： 即转录起始位点，其碱基大多为 A 。 2、TATA 框： 又称Hogness 框，由含有TATA 的6～7个核苷酸组成，保守序列为 TATA（A/T）A（A/T） 。 但TATA框的两侧富含G-C碱基对。 • TATA 框位于－25 附近，精确决定转录起始位点。 其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。

  30. 3、CAAT 框： • 位于 －75 附近，保守序列为 GGNCAATCT。 • 头两个 G 非常重要，一但突变，转录效率大大 • 下降。 • CAAT 框控制着转录起始的频率。 4、GC 框： 位于－110附近，以5 ′CCGCC 3′序列为特征。

  31. 5、增强子（enhancer）： • 能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间 • 特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。 • 增强子作用特点： • ⑴ 增强效应十分明显：使转录频率增加百倍或千倍。 • ⑵ 增强效应与其所处的位置和取向无关： • 增强子以5´→3´或 3´→5´排列对启动子都有作用。 • ⑶ 大多为重复序列：长约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。 • ⑷ 增强效应具有严密的组织和细胞特异性。 • ⑸ 没有基因专一性。 • ⑹ 许多增强子受外部信号的调控。

  32. 切离加尾 GCGC-CAAT-TATA-ATG AATAAA 内含子 外显子 修饰点 翻译起始 真正终止点 转录起始 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子 真核生物RNApolⅡ的启动子

  33. （三）RNA聚合酶 Ⅲ的启动子 即 tRNA基因的启动子，称Ⅲ类启动子。 • Ⅲ类启动子位于转录起始点下游，称 下游启动子或内部启动子。 • Ⅲ类启动子包括：A盒、B盒 • A盒靠近5′方向； B盒 靠近3 ′方向 。 • Ⅲ类启动子需要的转录因子包括： • TF Ⅲ C、TF Ⅲ B、TF Ⅲ A，前两者是共同 • 的，后者为5S rRNA基因转录所需。

  34. 原核生物 真核生物 帽子结构 没有 有 起始核苷酸 嘌呤或嘧啶 嘌呤（A为主） 启动区范围 较小(＋1～－70) 较大 (＋1～－110) 上游序列 TTGACA CAAT、GC、增强子 三、原核生物和真核生物 转录起始位点的结构差异

  35. 图5-4 P155页 原核生物与真核生物启动子比较

  36. 第 四 节 原核生物和真核生物转录及抑制剂 • 原核生物转录的起始 • 原核生物转录的延长 • 原核生物转录的终止与新合成RNA链的释放 • 真核生物的转录 • RNA生物合成抑制剂

  37. 一、原核生物转录的起始 • 转录起始需解决两个问题： • RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 • DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。

  38. 转录起始过程 1. 因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列） 2. RNA聚合酶全酶(2)与模板－35序列结合， 形成闭合的二元闭合启动子复合物。 3. RNA聚合酶向－10区转移，并与之牢固结合。 4. －10区DNA双链解开12～17bp，形成开放的二 元启动子复合物（模板－酶）。

  39. 转录起始复合物: RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 5. 在RNA聚合酶β亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板－酶－RNA）。 5-pppG -OH + NTP  5-pppGpN- OH 3 + ppi • RNA聚合酶有两个核苷酸结合位点： • 一个是起始核苷酸位点；一个是延长核苷酸位点。 • 一般只有嘌呤核苷酸填充了起始位点，才能形成 • 第一个磷酸二酯键。 6. 当三元复合物中RNA长6～9个核苷酸时，因子 从全酶解离下来，进入延长阶段。

  40. 二、原核生物转录的延长 1. 亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。 (NMP) n +NTP  (NMP) n+1 + PPi 3. 碱基配对原则：A-U，T-A，G-C 4. 延长中的转录复合物也叫转录空泡。随着RNA 聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录空泡， 已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。 5. 原核生物的转录和翻译偶联进行。

  41. 转录空泡(transcription bubble)： RNA-pol （核心酶）···· DNA ···· RNA

  42. DNA RNA 5 3 RNA聚合酶 核糖体 原核生物转录过程中的羽毛状现象

  43. 三、原核生物转录的终止和新生RNA链的释放 指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。 • 依赖ρ因子的转录终止 • 非依赖ρ因子的转录终止 分类

  44. （一） 依赖 ρ因子的转录终止 • 1969年，Roberts发现了能控制转录终止的蛋 白质，即ρ因子。 它由相同的6个亚基组成六聚体，分子量200kD。 • ρ因子具有NTP酶活性和解螺旋酶活性，是促 使转录三元复合物解离的根本原因。 ρ因子的 NTP酶活性依赖于单链RNA的结构。 • ρ因子依赖性终止子含有一个反向重复序列， 使RNA末端形成一个发夹结构，导致转录延宕， ρ因子得以发挥作用，终止转录。

  45. （二） 非依赖 ρ因子的转录终止 • DNA模板接近转录终止的区域内，有较密集 的A-T配对区或G-C配对区，且G-C配对为回 文结构。 • 转录产物RNA的3´-末端有若干个连续的U。 • 连续U区的5´-端前方碱基形成茎环结构或发 夹结构。这种二级结构是阻止转录继续向下 游推进的关键。

  46. CGCCCGA GCGGGCU 5´ 转录方向 模板链 5´ 3´ TCGGGCG AGCCCGC CGCCCGA GCGGGCT AAAAAA TTT TTT DNA 5´ 编码链 3´ 模板链 5´ 3´ AAAAAA UUUUUU DNA 3´ 5´ 编码链 3´ TTTTTT 转录产物

  47. RNA-pol 5 3 35 5´pppG 茎环结构使转录终止的机理 • 使RNA聚合酶变构，转录停顿； • 密集A-U 配对使转录复合物趋于解离，释放RNA。

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