1 / 28

DNA PÜRİFİKASYONU

DNA PÜRİFİKASYONU. DNA. Genetik bilgiyi taşıyan çift sarmal moleküldür. 5C’lu şeker, fosfat ve bazları içeren nükleotidlerden oluşur. Doğadaki canlıların tümüne yakın kısmında genetik materyal DNA’dır. DNA hücre içerisinde:. Çekirdek Mitokondri Kloroplastlarda bulunmaktadır.

hume
Download Presentation

DNA PÜRİFİKASYONU

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNA PÜRİFİKASYONU

  2. DNA • Genetik bilgiyi taşıyan • çift sarmal moleküldür. • 5C’lu şeker, fosfat ve bazları • içeren nükleotidlerden oluşur. • Doğadaki canlıların tümüne • yakın kısmında genetik materyal DNA’dır.

  3. DNA hücre içerisinde: • Çekirdek • Mitokondri • Kloroplastlarda • bulunmaktadır.

  4. DNA hücre içersinde serbest halde bulunmaz. Belli bir organizasyonu vardır. DNA nın çok büyük bir kısmı nukleusta , bir miktarı ise mitokondri ve kloroplastta bulunur. • DNA molekülleri nukleuslarda da serbest halde bulunmazlar. DNA kromatin iplikçikleri ve sonrada kromatinleri verecek şekilde özel bazı proteinler ve RNA ile bir kompleks yapı meydana getirir. Kromatin yapı taşı ;DNA, histon proteinler,histon • olmayan proteinler,HMG proteinler ve RNA dan meydana gelmiştir. ***HighMobilityGroup- hareket yeteneği yüksek grup olarak adlandırılan proteinler

  5. Bazı kimyasal maddeler ve enzimler ile canlı hücrelere ait hücre zarı veya canlı hücre duvarının yıkılıp DNA nın ortaya çıkarılmasına DNA saflaştırılması denir.Buda yukarıda bahsedilen yapıların (histon proteinler,non-histon proteinler,HMGler) hepsinin uzaklaştırılması durumudur.

  6. DNA PÜRİFİKASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR: 1- Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması, 2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi, 3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması,

  7. BAŞARILI BİR DNA SAFLAŞTIRILMASI İÇİN

  8. 1-Hücreselorganellerin açığa çıkması için hücre duvarı kırılmalıdır İlk aşama duvarın zayıflatılmasıdır.Fiziksel olarak dondurup çözme yada kimyasal maddeler kullanılarak yapılır. 2-Hücre membranı parçalanmalıdır. Bu sayede DNA ekstrasyonbuffer içinde serbest kalır.Bu genelde SDS gibi deterjanların kullanılması ile olur. 3-DNA nükleazlardan korunmalıdır. EDTA gibi deterjanlar bu yüzden kullanılır.

  9. 4-DNA protein kompleksinin çözünmesi. • Buffer/doku karışımına kloroform veya fenol karışımı eklenerek DNA’dan proteinlerin ayrılması sağlanır. • 5-DNA’nın kırılması en aza indirilmeli. • Solusyon içersindeki DNA çalkalanarak bile kırılabilir. • 6-DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması. • Genelde bu aşama DNA’nın fiziksel yada kimyasal etkilere maruz kalması ile sağlanır.Örneğin DNA kimyasal olarak çöktürülebilir.Bu işlemde en çok kullanılan kimyasal etanol’dür.Fiziksel uygulamada santrifüj yapılır.Santrifüj hızı ve zamanı ayrılması istenilen molekülün ağırlığına göre değişkenlik gösterir.

  10. Enzimler(RNase) RNA’yı yok etmek için, • Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı olarak bulunan proteinleri yok etmek için, • İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin çöktürülmesinde, • Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin çöktürülmesinde, • Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını bozmada, • Saflaştırılan DNA +4°C’da uzun süre saklanabilir.

  11. Bakterilerden kromozom(genom) DNA’sıpürifikasyonu: Organizma: E. coli , B. Subtilis

  12. PÜF NOKTALAR:

  13. Bitki hücreleri genelde çok sayıda sekonder bileşik içerir, bunun sonucu olarak belirli türlerde yüksek düzeydeki sekonder bileşikler DNA’nın saflığını bozmaktadır.Bu sorunun üstesinden gelmek içinalternatifekstrasyonbufferleri kullanılır. • DNA ekstrasyon • bufferlerıph • 8.0 hatta ph • 9.0 civarında • olmalıdır

  14. Kromozom dışı DNA’nın izolasyonu • Kromozom dışı DNA olarak bakterilerde plazmidadı verilen, sitoplazmada genom DNA’sından bağımsız replikasyon yapabilen, • çift zincirli, genellikle halkasal(ender olarak doğrusal) olan DNA molekülleri bulunmaktadır. • Ökaryotlarda ise nukleus DNA’sından bağımsız kalıtım gösteren organel DNA’larına mitokondri(mtDNA) ve kloroplastlarda(ctDNA) rastlanmaktadır. • Mitokondri ve Kloroplast DNA’sı, çift zincirli halkasal bir molekül olamakla birlikte boyutu organizmalara göre değişmektedir.

  15. Plazmid DNA’sı İzolasyonu • Plazmitlerinrekombinant DNA teknolojisi çalışmalarında taşıyıcı DNA(vektör) olarak geniş çapta kullanılması plazmid izolasyon yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır.

  16. Organel DNA’sı izolasyonu • Organel DNA’sı izolasyonlarında en önemli aşama öncelikle organelin parçalanmamış şekilde ayrılması olduğundan dolayı,bu olay 2 aşamada gerçekleştirilir. ***Organelin izolasyonu ***Organel DNA’sının izolasyonu

  17. Mitokondriyal DNA’nın saflaştırılması • Mitokondri İzolasyonu • Materyal: Somatik hibritlerin çeşitli bitki dokuları

  18. Mitokondri DNA’sı izolasyonu

  19. ANİMASYON

  20. SABIRLA DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜRLER

  21. SORULAR ?

More Related