Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica

1. Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica • Aplicações: • Descoberta de novas drogas, • Estudos em patologia, • - Diagnóstico, • Terapias, • Microbiologia, • Bioquímica, • Fisiologia de plantas, • Controle de qualidade.

2. Abordagens em Proteômica • Proteômica de Expressão • Expressão Diferencial • Proteômica Funcional • Interação Proteina-Proteina • Vias de Sinalização • Modificação Pós- traducional • Proteômica Quantitativa

3. REDE PROTEÔMICA DO RIO DE JANEIRO - CONFIGURAÇÃO ATUAL - 2005 2D LT FIOCRUZ MALDI TOF -IBf 2D DBqMED UFRJ MALDI TOF-TOF IOC Caracterização de proteínas 2D LQPP UENF Q-TOF - UENF UMG 2D IBf - UFRJ Q-TOF - IBqM LABIOS 2D IQ - UFRJ LBFP UERJ 2D LABORATORIOS. ASSOCIADOS RMN ESPEC MASSA – PUC AGROBIOLOGIA-EMBRAPA BIOQ UERJ 2D - 2D BIOINFORMATICA GEN UFRJ INCa

4. Análise proteômica comparativa de diferentes extratos proteicos isolados de cepas mutantes e selvagem de C. glabrata Penha, C. V. L., Bouchara, J. F., Lopes-Bezerra, L. M.

5. Candida glabrata Maior obstáculo nas infecções por C. glabrata resistência adquirida a terapias por azólicos Espécies mais comuns causadoras da candidíase invasiva Espécies Frequência Candida albicans 50% Candida tropicalis 15-30% Candida glabrata15-30% Candida parapsilosis 15-30% Candida krusei ~1% Candida lusitaniae ~1%

6. Potenciais mecanismos moleculares de resistência aos antifúngicos Alterações no processamento intracelular do antifúngico Modificação Degradação Alterações da enzima alvo Mutação pontual Superexpressão Amplificação gênica Conversão gênica ou recombinação mitótica Alterações de outras enzimas na via da biossíntese do ergosterol Bombas de efluxo Transportadores ABC “Major” Facilitadores

7. Objetivo Contribuir para o entendimento das prováveis modificações envolvidas nas respostas adaptativas dos fungos frente aos medicamentos antifúngicos Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos

8. Candida glabrata Cepa 1085 S = selvagem Cepa 178 = mutante, resistente a azolicos Proteínas Parede celular Citoplasma Microssoma

9. Candida glabrata Cepa 1085 s = selvagem Culturas Cepa 178 = mutante “ ’’ PMSF EDTA Pepstatina RNAse Bilhas de vidro braun

10. Centrifugação: 2’ 500 g  eliminação das bilhas de vidro 5’ 1000 g  pellet - C1 = parede 30’ 12000 g  pellet - C2 = mitocôndria 60’ 75000 g  pellet - C3 = microssoma Sobrenadante = proteínas do citosol C4

11. Solubilização de proteínas C1 C3  C2 “ ’’ Sonificação - 3 ciclos de 15’  Chaps  Uréia  DTT on Dosagem de Proteínas = Bradford C1, C3 e C4

12. Eletroforese Bidimensional (Strip 18 cm -Gel 12%) A) 1085-S B) 1085-BET Mr (kDa) 250 150 100 37 25  Mr (kDa) 250 150 100 37 25   IEF  IEF  SDS  SDS 3,0 11,0 pI 3,0 11,0 pI

13. Spots 1085-S 1085-BET 187 110 168 Matching Spots Two-dye overlay (1085-S/1085-BET) 1085-S = azul 1085-BET= vermelho

14. 1 2 5 6 3 4 58 7 8 9 12 11 10 13 14 61 15 16 17 63 57 24 62 18 26 27 19 20 22 23 28 21 29 25 56 35 59 33 30 60 31 37 36 34 32 42 39 40 38 41 43 44 45 48 46 47 50 49 51 53 52 54 55 Identificação por MALDI TOF/TOF 3,0 IEF 11,0 Piruvato decarboxilase Fosfohexose isomerase Enolase Frutose 1,6 bifosfato aldolase Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

15. “Expressão diferencial de proteínas da parede celular de leveduras e conídios do fungo dimórfico Sporothrix schenkii” In collaboration with the Department of Cellular Biology and Genetics UERJ

16. PREMISES • etiological agent of feline and human sporotrichosis • most common Latin America mycosis • can affect tissues and internal organs • dangerous to immunosupressed individuals • morphological transition is a key factor in virulence GOALS - understand the physiopathology of disseminated sporotrichosis - identify virulence factors/ molecular biomarkers

17. 2D-PAGE dos CWPs obtidos da parede celular de diferentes formas do S. schenckii 3,0 IPG 10,0 3,0 IPG 10,0

18. Tabela 1 Tabela 1 - - Quantificação das proteínas expressas ( Quantificação das proteínas expressas ( spots spots ) na parede celular da forma de levedura e de conídios ) na parede celular da forma de levedura e de conídios nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivo nos géis 2D, e sua distribuição percentual segundo os respectivo s pontos isoelétricos. s pontos isoelétricos. ° ° a a Morfologia Morfologia n n de spots de spots Percentual de prote Percentual de prote í í nas por faixa de pH nas por faixa de pH pI pI 3,0 3,0 – – 5,0 5,0 pI pI 5,0 5,0 – – 7,0 7,0 pI pI 7,0 7,0 – – 10,0 10,0 Levedura Levedura 233 233 18,4% 58,0% 18,4% 58,0% 23,6% 23,6% Con Con í í dio dio 112 112 29,5% 29,5% 54,5% 54,5% 16,0% 16,0% a a - - foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente foram utilizadas tiras de focalização isoelétrica em gradiente de pH de 3,0 a 10,0. de pH de 3,0 a 10,0.

19. Two-dye overlay (Levedura/Conídio) 4,0 IPG 7,0 A SDS ° ° B N N de de Spots Spots Lev Con Lev Con 141 141 32 32 32 32 Interseção levedura - azul conídio - vermelho

20. O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA?

21. O QUE FOI ENCONTRADO UTILIZANDO PROTEÔMICA? SÓ ISSO?!

25. Uma visão para o futuro.... produtos metabólicos fragmentos gerados enzimáticamente

27. SELDI - Surface Enhanced Laser Desorption Ionization

29. Geração sistemática de anticorpos monoespecíficos para explorar o proteoma humano. - Análise de padrões de expressão protéica e localização subcelular; - Investigação de vias de interação; - Variantes resultantes de splicing; - Modificações pós-traducionais.

30. > 400 genes humanos 100-150 aa consecutivos

33. PERSPECTIVAS Conjunto de proteínas humanas não-redundantes (proteína representativa por locus genético) estimado em 20 a 25 mil; Produção de milhares de msAb possível por ano com essa nova técnica; Previsão para completar o projeto em alguns anos.