第二节 RNA 的生物合成

1. 第二节 RNA的生物合成

2. 一. 概论 1. 转录的反应 n1 ATP n2 CTP RNA聚合酶 RNA +（n1+n2+n3+n4)PPi n3 GTP DNA模板 n4 UTP 定义：从DNA区段(基因)中的一条链为模板，在RNA聚合酶的催化下，以四种核苷酸为原料，按照A-U，G-C配对原则合成RNA

3. 一. 概论 2. 转录的方式 • 特点： • 不对称转录--我们将用作RNA合成的模板的链叫做反义链；另一条不做模板的链叫有义链。RNA为全保留转录 • 转录开始不需要引物，链的延长方向也是 5′→ 3′ • RNA聚合酶对利福平敏感

4. 一. 概论 2. 转录的方式

5. 一. 概论 2. 转录的方式 对于整个DNA双链，每条链上有的区段用作有义链，有的区段用作反义链。所以，具有相对意义。

6. 1.转录的酶 二. 原核生物转录 ——RNA聚合酶 亚基组成：a2bb'ws = a2bb'w + s 全酶 核心酶 a亚基—— 解开前方的DNA双螺旋、恢复后面的DNA双螺旋 b亚基—— 催化磷酸二酯键的形成 b'亚基—— 与DNA的非模板链结合

7. 1.转录的酶 二. 原核生物转录 亚基组成：a2bb'ws = a2bb'w + s 全酶 核心酶 s亚基：识别DNA上转录的起始部位，从而引导全酶结合上去 核心酶：解开前方的DNA双螺旋、RNA链的延伸、恢复后面的DNA双螺旋 此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。

8. 2.转录过程-转录启动 二. 原核生物转录 DNA上存在着转录的起始信号，它是特殊的核苷酸序列，称为启动子（promoter）。转录是由RNA聚合酶全酶结合于启动子而被启动的。

9. 2.转录过程-转录启动 二. 原核生物转录 The nucleotide sequences of representative E. coli promoters

10. 2.转录过程-转录启动 二. 原核生物转录 聚合酶全酶上的s因子能识别启动子，并识别有义链，从而使全酶定位到启动子部位。

12. 如何确定启动子部位？ DNA Foot- printing

13. 2.转录过程-转录启动 二. 原核生物转录 由全酶在启动子附近将DNA局部解链，约解开17个碱基对。（酶与启动子结合的部位是AT富集区，有利于解链） 第一个核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)结合到全酶上，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起始复合物。 第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的3'羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。 s因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。

14. 2.转录过程-链的延伸 二. 原核生物转录 当s因子从核心酶上脱落后，核心酶与DNA链的结合变得疏松(依靠其蛋白质的碱性与酸性核酸之间的非特异性的静电引力)，可以在模板链上滑动，方向为DNA模板链的 3′→ 5′，同时将核苷酸逐个加到RNA链的3'-OH端，使RNA链以 5′→ 3′方向延伸。

15. 2.转录过程-链的延伸 二. 原核生物转录 DNA上的解螺旋区：在RNA链延伸的同时，RNA聚合酶继续解开它前方的DNA双螺旋，暴露出新的模板链，而后面被解开的两条DNA单链又重新形成双螺旋，DNA上的解螺旋区保持约17个碱基对的长度。

16. 2.转录过程-链的延伸 二. 原核生物转录 RNA-DNA杂交区：刚合成出来的RNA链与解开的DNA模板链之间可形成一小段RNA-DNA杂交区。随着核心酶的移动，RNA链不断地延伸，杂交区也往前延伸，但后面的杂交区随着DNA双螺旋的回复，RNA链逐渐被置换出来，因此，杂交区也保持着固定一小段。

17. 2.转录过程-终止 二. 原核生物转录 DNA分子上有终止转录的特殊信号，也是特定的核苷酸序列，称为终止子。 • 核心酶能识别终止子，停止转录。 • 这一过程有时需要一种蛋白质 ——因子的帮助（当终止信号较弱时）；有时不需要（当终止信号较强时）。 • 核心酶释放出RNA，自己也离开DNA。 • DNA上的解链区重新形成双螺旋。

18. 1.真核细胞的聚合酶 三. 真核生物转录 • 真核细胞的转录比较复杂。真核基因的顺式作用元件（cis-acting element），即DNA上对基因表达有调节活性的特定序列，按其功能可分为启动子、增强子（enhancer）和沉默子（silencer）等。真核生物的转录，是由RNA聚合酶与这些元件相互作用，在蛋白质辅助因子ρ的协同下完成的。

19. 1.真核细胞的聚合酶 三. 真核生物转录

20. 2.真核细胞的启动子 三. 真核生物转录 真核细胞启动子是指通用(基础)转录因子和RNA聚合酶II通过相互作用，组装转录起始复合体的位点。

21. 2.真核细胞的启动子 三. 真核生物转录

23. 真核生物启动子的多元性 启动子包括 TATA序列(TATA box)：-25  -35 TATA box的作用：使转录精确地起始； 启动子是指确保转录精确而有效地起始的DNA序列； TATA序列也叫核心启动元件 (core promoter element)

24. CCAAT序列(CAAT box) ：-70  -80 CAAT区主要控制转录起始频率。 (GC box) GCCACACCC或GGGCGGG序： -80  -110; GC区主要控制转录起始频率。

26. 增强子、及其对转录的影响 a 增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列； b 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍； c 增强效应与其位子和取向无关； 3.真核细胞的增强子 三. 真核生物转录

27. d 大多为重复序列，一般长度为50 bp，其内部常含有一个核心序列(G)TGGA/TA/TA/T(G)； e 增强效应有严密的组织和细胞特异性； f 没有基因专一性； g 许多增强子还受外部信号的调控。

28. Enhancer 的结构与功能 双方向性，组织特异性，位点非专一性 ----Enhancer 由两个以上的增强子成分(Enhancer Element)组成 ----Enhancer Element 必需由两个紧密相连, 具有间距效应的 增强子元 (Enhanson）组成 ----各个Enhanson(cis-factor)与激活蛋白(trans-factor)结合 增强特异性转录

29. En. Elem. En. Elem En. Elem. -250 -180 coreC TCII TCI sphII sphI Ap3 Ap2 Ap1 基本转录复合体 促进转录复合体 mRNA GC CAAT TATA e.g. SV40 Enhancer (-179~ -250) 远距离控制，无方向性 +1

30. 4.基因沉默-iRNA 三. 真核生物转录 What is RNA interference (RNAi) • RNA interference (RNAi) represents a mechanism invented by nature to protect the genome. In the past few years the field has emerged at a surprisingly high pace. • The whole story started when Fire et al. (1998) identified double stranded RNA (dsRNA) as the mediator of gene silencing in C. elegans and referred to the term RNAi.

31. What is RNA interference (RNAi) • The underlying molecular mechanism of gene silencing provides us with short interfering RNAs (siRNAs) which allows to target any gene with high specificity and efficiency.

32. What is the outcome, indeed ? • Introduction into cells of a double-stranded RNA corresponding to an expressed gene leads to down-regulation of that gene through degradation of its mRNA

33. How does the siRNA work ? • Introduction of synthetic small double-strand oligonucleotide (21-23 nt length) corresponding to specific gene into cell will specifically knock down corresponding mRNA in the cell

34. An enzyme complex (Dicer), was discovered in Drosophila (Bernstein et al., 2001) as part of a conserved Dicer family expressed in organisms undergoing RNAi. Dicer contains domains for dsRNA binding, RNA unwinding, and ribonuclease activity, and is associated with additional proteins to drive the cleavage of dsRNA in an ATPdependent manner. The resulting siRNA as part of a multiprotein RNA-inducing silencing complex (RISC) is targeted to the complementary RNA species which is then cleaved.

35. siRNA: Small interfering RNA

37. 5.转录因子 三. 真核生物转录 真核基因转录的蛋白因子 为蛋白质编码的基因的准确转录受多种转录因子的调控。RNA聚合酶必须在特定的转录因子的参与下才能起始转录。 至今有20种以上蛋白因子参与转录起始，可分为三类： • 通用(基础)转录因子(basal transcriptional activity)： • 包括TF II A、TF II B、 TF II D、 TF II E、TF II F、TF II H、TF II J等。这些蛋白因子对于准确转录起始是必需的。

38. 2. 启动子特异性转录激活蛋白 (promoter-specific transcriptional activators) 它们通过与启动了附近或远离启动子的DNA分子上调控区(增强子)相结合，作用于转录起始复合体组装过程，具有DNA结合域和激活转录所需要的激活结构域。

39. 一般情况，细胞中通用转录因子的种类同基因转录的调控蛋白因子(包括转录激活蛋白、辅助激活蛋白、负调控蛋白因子等)相比，数量较少，但在细胞中的含量是丰富的； 这些通用转录因子在启动子区同RNA聚合酶一起组装成转录起始复合物;

40. 特异性调控蛋白因子种类繁多，但含量即非常之少，它们通过其DNA结合域识别特定的DNA序列，这种特性决定了特异性开或关。

41. Specific Trans-factor characteristics l多为变构蛋白，具有两个功能结构域（domain） DNA-binding domain activation domain Dimerization domain (in some dimer factor) DNA-binding domain activation domain

42. 一般状态 （无活性） • Transcription activation domain • have a very high proportion of acidic amino acid (also called acidic domain or acid blobs or negative noodles) Trans-factor的活性调节受到严格的信号因子的调控 变构 signal 活化状态 激活转录 binding DNA

43. 几种常见的DNA结合蛋白的结构

44. Helix-turn-helix motif

45. Helix-turn-helix domain and binding with DNA

46. 亮氨酸“拉链”式二聚体 亮氨酸“拉链”(leucine zipper)指调控蛋白中发现的一段富含亮氨酸序列，这个区域易于形成两性-螺旋或卷曲螺旋构象，这些蛋白能形成稳定的二聚体。转录因子在模板DNA上形成同源(或异源)二聚体的能力决定了基因表达。

47. 亮氨酸“拉链”式二聚体 在“拉链”式蛋白中，“拉链”区以外的氨基酸在都呈碱性，具有结合DNA的本领， “拉链”的吻合有利于形成平行的二重DNA结合区。

48. Monomeric & dimeric structure of Luc zipper Luc zipper dimerization

49. Zinc finger region TF III A 蛋白具有9个相似的重复单位 每个单位大约由30个氨基酸残基组成 一对半胱氨酸 Zinc finger region 一对组氨酸残基 zinc

50. Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His 单个锌指的保守区序列