Probleme generale ale analizei medicamentelor

1. Probleme generale ale analizei medicamentelor FR X - capitolul “Monografii- Metode generale de analiză”: • Prelevarea probelor pentru analiză. • Controlul organoleptic • Determinări fizice şi fizico-chimice • Determinări cantitative • Determinări farmacognostice • Determinări farmacotehnice • Determinări biologice şi biochimice • Controlul preparatelor radiofarmaceutice • Analiza medicamentului defineste in sens larg examinarea partilor constituiente ale unui intreg reprezentat de medicament, presupunand specific determinarea calitativa si/sau cantitativa a compozitiei si/sau structurii substantelor sau amestecurilor utilizand strategii, metode si instrumente caracteristice. 1

2. MEDICAMENT/ SUBSTANTA MEDICAMENTOASA 1. Prelevarea probei PROBA REPREZENTATIVA PROBA FINALA DE ANALIZAT 2. Pregatirea probei pentru analiza 3. Determinari experimentale (preliminare, calitative, cantitative) - direct, fara pregatire -dupa o prelucrare specifica DATE EXPERIMENTALE 4. Evaluarea critica a rezultatelor REZULTATUL ANALIZEI BULETIN DE ANALIZA 2

3. PRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZA « Probele prelevate pentru determinarile calitativeşi cantitative trebuie să reprezinte, sub toate aspectele, caracteristicile produsului din lotul sau seria respectiva» (FR-X) FR-X: • lot - o cantitate de materie primă, presupusă a fi unitară, din care se obţin una sau mai multe serii de produse • serie - totalitatea unităţilor de produs obţinute în condiţii identice, într-un singur ciclu de operaţii • recipient - conţine unităţile de produs care constituie o serie, ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc. • ambalaj - conţine recipientele grupate adecvat 3

4. Laborator Cantitate – 3p 2p proba 1p contraproba 4

5. CONTROLUL ORGANOLEPTIC Aspect Miros CONTROL ORGANOLEPTIC Gust Culoare 5

6. DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE ŞI CHIMICE DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII • prevederile de la alineatul "Solubilitate" au un caracter orientativ privind solubilitatea substanţelor în diferiţi solvenţi • prevederile înscrise în cadrul altor alineate, cum ar fi "solubilitatea în alcool", au un caracter obligatoriu, fiind considerate teste de puritate • Solubilitatea poate fi exprimată prin specificarea volumului de solvent (în mililitri) necesar pentru a dizolva 1 g substanţă solidă sau 1 ml substanţă lichidă, la temperatura de 20  20C. • Verificarea solubilităţii substanţelor farmaceutice nu este necesar să se efectueze în toţi solvenţii prevăzuţi în monografie, ci este necesar să se controleze solubilitatea în cel puţin doi solvenţi diferiţi. • Dacă se constată prezenţa unor impurităţi insolubile, se verifică solubilitatea şi în ceilalţi solvenţi prevăzuţi. 6

7. Diferitele solubilităţi pot fi exprimate şi cu ajutorul unor expresii - în acest caz prevederile de solubilitate se referă la temperatura de 20  5oC. 7

8. DETERMINAREA INDICILOR • Indice de aciditate = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor graşi liberi conţinuţi în 1 g probă de analizat (uleiuri volatile, uleiuri grase, balsamuri, ceruri etc.). • Se calculează conform formulei: în care: - IA = indice de aciditate - V = volumul de KOH 0.1 mol/l în apă folosit la titrare (ml) - m = masa probei luate în lucru (grame) - 5.61 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.1 mol/l. 8

9. Indice de saponificare = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor liberi şi a acizilor rezultaţi din saponificarea a 1 g probă de analizat. Se calculează conform formulei: în care: - IS = indice de saponificare - V1 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea martorului (ml) - V2 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea probei (ml) - m = masa probei luate în lucru (grame) - 28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.5 mol/l în alcool. 9

10. Indice de ester = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor graşi rezultaţi din saponificarea a 1 g probă de analizat. Se calculează conform formulei: în care: - IE= indice de ester - IS = indice de saponificare - IA= indice de aciditate. 10

11. Indice de hidroxil = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1 g probă de analizat. • Se calculează conform formulei: în care: - IH= indice de hidroxil - V1= volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea martorului (ml) - V2 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea probei (ml) - m = masa probei luate în lucru (grame) - IA = indice de aciditate -28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.5 mol/l în alcool. 11

12. Indice de iod = numărul de grame de iod fixat de 100 g probă de analizat. • Se calculează conform formulei: în care: - II= indice de iod - V1 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea martorului (ml) - V2= volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea probei (ml) - m = masa probei luate în lucru (grame) - 0.01269 = numărul de grame de iod corespunzător la 1 ml Na2S2O3 0.1 mol/l. 12

13. Indice de peroxid = numărul de mililitri de tiosulfat de sodiu 0.01 mol/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin acţiunea peroxizilor din 1 g probă de analizat. • Se calculează conform formulei: în care: - IP = indice de peroxid - V1 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea martorului (ml) - V2 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea probei (ml) - m = masa probei luate în lucru (grame). 13

14. DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE • Punct de topire = temperatura la care o substanţă se topeşte complet. • Dacă substanţa se topeşte cu descompunere, se consideră punct de topire sau punct de descompunere, temperatura la care substanţa îşi schimbă aspectul (se brunifică sau apar bule de gaze). • p.t. substanţe solide pulverizabile • se efectuează în dispozitive speciale sau într-un balon Kjeldahl cu capacitatea de 150 - 250 ml, în care se introduce un termometru potrivit. • la termometru se ataşează, cu ajutorul unui inel de cauciuc sau prin aderenţă, un tub capilar din sticlă, închis la un capăt. • ca lichid de încălzire se foloseşte: • apa distilată – p.t. < 700C • parafina lichidă, acidul sulfuric sau uleiul de silicon - p.t> 700C 14

15. Determinare: • proba de analizat pulverizată şi uscată se introduce în tubul capilar şi se tasează pentru a forma un strat compact de 3 - 4 mm înălţime • tubul capilar se ataşează la termometru • incălzirea se efectuează astfel încât temperatura să se ridice cu 3 - 40C/minut. • se citeşte temperatura la care substanţa se topeşte complet. • În cazul substanţelor care se descompun prin încălzire prelungită, balonul se încălzeşte, în prealabil, până la o temperatură cu aproximativ 100C sub punctul de topire presupus, după care se ataşează capilarul cu substanţa şi se continuă încălzirea astfel încât temperatura să se ridice cu 1 - 20C/minut. • Dacă punctul de topire al probei de analizat nu este cunoscut, se efectuează, în prealabil, o determinare orientativă. 15

16. În unele cazuri, specificate în monografii, punctul de topire se determină cu un microscop special prevăzut cu un dispozitiv de încălzire. Termomicroscopie ( microscop Boetius ) 1 – sursă de lumină 2 – masă de probăîncălzită 3 – termometru 4 – obiectiv 5 – sursă de lumină 6 – ocular 7 – mâner pentru poziţionarea probei 16

17. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ÎN ALCOOL • se bazează pe distilarea alcoolului • se determina densitatea sau indicele de refracţie a distilatului hidroalcoolic. • Determinare: • se foloseşte un aparat de distilare cu alonjă care trebuie să pătrundă în apă • se distilă nu mai mult de 30 minute • se determină densitatea relativă cu ajutorul picnometrului şi se citeste concentraţia în alcool a distilatului (% m/V) din tabele alcoolmetrice. • se calculează dupa formula: în care: - c = concentraţia în alcool a distilatului corespunzătoare densităţii relative (% m/V) - m = masa probei luate în lucru (g). 17

18. METODE DE SEPARARE prin volatilizare - Distilare cromatografice prin extracţie: - lichid-lichid - solid-lichid - in faza solida - cu fluide supercritice 18

19. METODE DE SEPARARE PRIN VOLATILIZARE - DISTILAREA - Distilarea este una din cele mai vechi metode de separare si purificare a lichidelor. Separarea se bazează pe diferenţele dintre presiunile de vapori ale lichidelor care compun un amestec. Pe scurt, distilarea presupune încălzirea lichidelor, separând vaporii si recondensându-i pentru a obţine un nou lichid care va fi concentrat în compuşi mai volatili. PARAMETRII DE LUCRU ŞI EFICIENŢĂ: • echilibrul de distributie vapori-lichid • volatilitatea relativa • talerul teoretic 19

20. Curbe de distilare 20

21. METODE DE SEPARARE PRIN EXTRACTIE EXTRACŢIA LICHID – LICHID Extracţie = transferul unei substanţe dizolvate dintr-un solvent în alt solvent nemiscibil cu primul. Distribuţia substanţei respective între cele două faze depinde de solubilitatea acesteia în cei doi solvenţi. Componenţii supuşi distribuţiei interfazice manifestă preferinţe pentru unul sau altul dintre solvenţi, participând selectiv la procesul de transfer. Dacă la echilibru concentraţiile componenţilor sunt sensibil diferite între cei doi solvenţi, procesul poate fi utilizat în scopul separării lor. 21

22. Etape in extracţia lichid – lichid: Etapa cea mai importantă este cea de selecţionare a sistemului de solvenţi şi stabilirea formei sub care este extrasă substanţa. Aceasta se poate realiza prin cunoaşterea parametrilor procesului de extracţie care sunt: ● constanta de repartiţie ● coeficientul de extracţie ● factorul de recuperare. • formarea speciei extractibile şi punerea sa în contact cu sistemul de solvenţi adecvaţi 2. sedimentarea 3. decantarea 4. determinarea cantitativă a componenţilor izolaţi 5. recuperarea solvenţilor 22

23. PROCEDEE DE EXTRACŢIE LICHID-LICHID După sensul de curgere al lichidului şi după principiul de funcţionare al instalaţiei: 1. Extracţia simplă 2. Extracţia continuă 3. Distribuţia în contracurent. 23

24. EXTRACŢIA SOLID-LICHID Principii generale se aplică atunci cand este o fază solidă sau semi-solidă (material vegetal, pulberi de forme farmaceutice solide etc.) implică operaţiile de extracţie de tip percolare, filtrare şi spălare. Are 2 etape, realizate în acelaşi aparat sau în aparate separate: contactul solventului cu materialul solid supus extracţiei şi transferul constituientului solubil (solut) în solvent separarea sau spălarea soluţiei de reziduul solid Procesul complet include recuperarea solutului separat şi a solventului, prin evaporare sau distilare. APARATURA depinde de prima etapă termeni ce indicǎ tipul de aparat utilizat: “solid bed” sau “fixed bed” - se referă la orice operaţie în care prin materialul solid fix trece solventul utilizat pentru extracţie “dispersed contact” - se referă la operaţiile în care particulele solide, suspendate în fluid sunt în mişcare relativă unele faţă de altele şi faţă de solvent, în timpul contactului solid-solvent. 24

25. EXTRACTIA IN FAZA SOLIDA (SOLID-PHASE-EXTRACTION, SPE) este un proces de separare prin care compuşi dizolvaţi sau suspendaţi într-un amestec lichid sunt separaţi de alti compusi din amestec în funcţie de proprietăţile lor fizice şi chimice poate fi folosită pentru a izola analiţii de interes dintr-o mare varietate de matrici, inclusiv urină, sânge, apă, băuturi, sol, şi ţesuturi de origine animală utilizează afinitatea substanţelor dizolvate sau suspendate într-un lichid (faza mobilă), pentru un solid prin care proba este trecută (faza staţionară) pentru a separa dintr-un amestec componentele dorite şi nedorite rezultatul analiţii de interes doriţi sau impurităţile nedorite din proba sunt reţinute pe faza staţionară partea care trece prin faza staţionară este colectată sau casată (daca conţine analiţii doriţi sau impurităţile nedorite) in cazul în care porţiunea reţinută în faza staţionară include analiţii doriţi, aceştia pot fi apoi separaţi din faza staţionară prin colectare printr-un proces suplimentar, în care faza staţionară se spală cu un eluent corespunzător.

26. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTĂ PERFORMANŢĂHIGH PERFORMANCE/PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) Cromatografia de lichide de înaltă performanţă/înaltă presiune (High Performance/Pressure Liquid Chromatography - HPLC) sau de înaltă viteză (High Speed Liquid Chromatography – HSLC) este o tehnică: modernă şi rapidă care elimină unele dezavantaje ale cromatografiei planare utilizată pentru separarea şi determinarea soluţilor organici şi anorganici din orice probe, în special substanţe şi produse farmaceutice, biologice, alimentare, industriale, de mediu etc. Clasificare În funcţie de mecanismele care stau la baza separării componentelor, cromatografia de lichide  se clasificǎ astfel: cromatografie prin adsorbţie cromatografie prin repartiţie cromatografie cu faze inverse cromatografie prin schimb ionic cromatografie prin excluziune moleculară.

27. APARATURA Schema unui cromatograf HPLC • 1-2 sau mai multe rezervoare cu solventi • o pompă de înaltă presiune • sistem de degazare • injector pentru introducerea probei • (precoloane) coloane cromatografice • detectoare • sistem de prelucrare a datelor

28. APLICAŢIILE HPLC ANALIZA CALITATIVA Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase Identificarea unui component prezent intr-un amestec se poate face dupa cromatografiere prin: Metode cromatografice: - Dupa marimile de retentie - Metoda adaosului standard - Metoda retentiei relative Metode spectrale Alcaloizi din ergot elimoclavina lisergol

29. Atenolol • Bupivacaina

30. Efedrina • Ketoconazol Condiţii: • Coloana: (S,S)Whelk-O 1 • 10/100(FEC) 25 x 4.6 mm • Faza mobilã: Diclormetan-hexan-IPA + 0.011 M acetat de amoniu (46:46:8) • Viteza de curgere: 1.5 m>/min • Detecţie: 254 nm • Timp de reţinere: 16 min • K’ = 6.60 •  = 1.19

31. Analiza produşilor modificaţi chimic (prin derivatizare) este adesea necesară pentru a atinge o cromatografie satisfăcătoare. se aplică pentru componentele de toate polarităţile şi greutăţile moleculare şi este un avantaj al HPLC faţă de gaz-cromatografie. Este utilizată pentru a creşte sensibilitatea detecţiei cand detectările utilizate nu sunt satisfăcătoare pentru componentele nederivate. Absorbţia în UV şi fluorescenţa pot fi obţinute cu ajutorul unor reactivi. UV: N-succinimid-p-nitrofenilacetat (SNPA), fenilhidrazină şi 3,5-dinitrobenzen (DNBC). derivaţii fluorescenţi pot fi formaţi cu agenţi de tipul: cloruri de dansil (DNS-Cl), 4-bromometil-7-metoxicumarina (BMC) şi cu unele amine fluorescente.

32. Detectarea imunologică Tehnica implică colectarea de solvent în fracţiuni mici (1 ml) şi prelevări de medicament în fracţiuni. Necesitã mult timp, dar au reversibilitate şi selectivitate mai mare decat detectările convenţionale. În multe cazuri, lichidele biologice pot fi injectate direct în coloană. HPLC cu detectare imunologică este utilizată pentru analiza metaboliţilor care sunt dificil de izolat din lichidele biologice prin extracţie (glucuronidele). Astfel de compuşi polari nu pot fi observaţi în concentraţii mici prin detectări convenţionale, ele fiind mascate de componentele endogene. Poate fi utilizată pentru determinarea: canabinoidelor, opioidelor, lisergidelor, glicozidelor cardiotonice din lichidele biologice.

33. ANALIZA CANTITATIVA • Se bazeaza pe corelatia care exista intre aria (inaltimea) picului si concentratia componentului respectiv. • Metodele de determinare constau in masurarea: • Aria picului: - metode manuale - metode electronice • Concentratia probei: - metoda normarii ariilor - calibrare cu standard extern - metoda standardului intern - metoda adausului standard

34. Determinarea cantitativã a substanţelor farmaceutice Determinarea cantitativã a vitaminei B-12 din ser Condiţii: HPLC/ICP-MS ICP = Inductively coupled plasma emission spectrometer HPLC/ICP-MS cu sistem de lucru LC-10A, ELAN6100, Waitress’s LC Coloana:COSMOSIL, 5C18-AR Faza mobilã: apã-ac.acetic-isopropanol (90:1:9) Viteza de curgere: 10 ml/min Determinarea amitriptilinei şi perfenazinei Condiţii: HPLC/Agilent 1000 Coloana: cianopropil Faza mobilã: acetonitril-metanol-fosfat monopotasic Viteza de curgere 2.0 mL/min Detecţie: UV 215 nm

35. Determinarea omapatrilatului din plasmã (inhibitor de endopeptidazã) Alte determinǎri cantitative Determinarea activităţii antioxidante a capsaicinei; Determinarea cantitativă a aminoacizilor din lichidul cefalorahidian; Determinarea cantitativǎ a cumarinei din extracte alcoolice. Condiţii • HPLC: Waters 510 HPLC pump, Waters automated gradient • Coloana analiticã BDS Hypercil C8 (3 m, 50 mm×2 mm ID) precedatã de Hypercil C8. • Faza mobilã: 62.5 % apã şi 37.5 % acetonitril, cu acetat de amoniu 1 mmol/L la pH 5.5. • Viteza de curgere: 0.2 mL/min, • Volumul injectat 25 L.

36. Definitie   Atunci când se foloseşte un gaz ca fază mobilă într-un sistem cromatografic, tehnica este denumită gaz-cromatografie (GC, cromatografie de gaze, cromatografie in faza gazoasa). Această tehnică se efectuează întotdeauna într-o coloană cromatografică deoarece faza mobilă trebuie să curgă în mod continuu. Clasificare cromatografia gaz-lichid (GLC): - faza staţionară este un lichid - fenomenul de separare are loc prin repartiţie cromatografică cromatografia gaz-solid (GSC) - faza staţionară este o suprafaţă solidă - fenomenul de separare are loc prin adsorbţie. GAZ – CROMATOGRAFIAGAS-CHROMATOGRAPHY (GC)

37. H RESET Air Hydrogen Gas Carrier APARATURA Filters/Traps Data system Regulators Syringe/Sampler Inlets Detectors Column

38. APLICAŢIILE GAZ-CROMATOGRAFIEI 1. Identificarea compuşilor medicamentoşi si cercetarea impuritatilor se folosesc mărimile de reţinere VR şi tR identitatea timpului de reţinere al unui component cu acela al aceluiaşi component pur oferă un indiciu că cei doi componenţi sunt identici timpii de reţinere sunt proporţionali cu punctele de fierbere ale componenţilor care ies din coloană în ordinea acestora folosind diferite faze staţionare selective componenţii se pot separa chiar dacă au aceleaşi puncte de fierbere timpul de retenţie depinde de diferiţi factori (lungimea coloanei, diametru, temperatura). Din această cauză, în scopuri calitative se utilizează aşa-numiţii timpi de retenţie relativi, trr, definiţi prin relaţia: unde: tA = timpul de retenţie al componentei A; tet = timpul de retenţie al etalonului.

39. Se practică adăugarea în amestecul de analizat a unei componente pure. Dacă are loc creşterea pe cromatogramă a maximului ce corespunde componentului adăugat, aceasta se consideră drept dovadă a identităţii componentei - etalon. Operaţia se efectuează pentru aceeaşi probă de analizat pe mai multe coloane cu diferiţi adsorbanţi. 2.Studii de stabilitate pentru materii prime si produse finite cu posibilitatea identificarii produsilor de degradare. 3.Studii farmacocinetice – studii de biodisponibilitate (determinarea concentratiei plasmatice).

40. 4. Determinarea cantitativă a compuşilor medicamentoşi Principala problemă a analizei cantitative în gaz-cromatografie este măsurarea ariei picurilor. Aria picurilor este proporţională cu cantitatea de substanţă ce se găseşte în zona eluată. Aria maximului picului poate fi calculată prin mai multe metode: măsurarea înălţimii maximului simetric, considerându-l de forma unui triunghi, când aria este proporţională cu înălţimea: metodă destul de precisă, dar exactitatea ei depinde de măsura în care forma maximului rămâne neschimbată dacă cantitatea de substanţă variază. - planimetrarea ariei de sub pic - aparatele moderne evalueaza ariile cu ajutorul dispozitivelor de integrare şi a computerelor. Prin metodele enumerate se măsoară aria sau cantitatea de substanţă proporţională cu aria de sub pic. Aceste cantităţi trebuie transformate în valori sau procente ale componenţilor analizaţi. - Gaz-cromatografele moderne efectuează automat determinările cantitative prin ataşarea la aparat a unui calculator adecvat.

41. Definitie: Este o tehnica cromatografica in care faza staţionară este constituita din compuşi în a căror structură se află grupări acide sau bazice ionizabile capabile să reţină cationi sau anioni, in anumite conditii experimentale. Aceşti compuşi poartă numele de răşini schimbătoare de ioni. Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de alţi ioni fie din faza mobilă, fie din probă, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic. Clasificare: cromatografie de schimb cationic: schimbătorul reţine ionii încărcaţi pozitiv, înlocuind ionul H+ al acestuia Ex:(-SO3H, -PO3H2) cromatografie de schimb anionic: schimbătorul reţine ionii încărcaţi negativ, inlocuind ionul X- al acestuia Ex: (-RN+H3X-) CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONICION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)

42. 1 2 3 4

43. APARATURA

44. APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI IONICE Cromatografia ionica se dezvoltă în zilele noastre cu aplicaţii în: analiza medicamentelor chimia anorganică chimia organică

45. Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) derivă din metodele convenţionale ale cromatografiei de lichide, în special din HPLC şi din gaz-cromatografie (GC), fiind o metodă de separare puternică şi universală, atât la scară analitică, cât şi la scară preparativă. Relaţia celor trei tipuri de cromatografie este redatã ma jos: CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICESUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)

47. Caracterisiticile fluidelor supercritice

48. APARATURA

49. APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE 1. Determinarea unor sulfonamide Condiţii: Aparatura: Sistem Gilson SF3 pSFC Coloana: 250 x 4,6 mm cu fazã staţionarã cianopropil (mãrimea particulelor 5 mm) Temperatura: 50o C Sistem injecţie: Model 7125, 10 ml Faza mobilã: CO2 modificat cu metanol (10% primele 5 minute, creştere liniarã la 15% timp de 10 minute) Viteza de curgere: 2 ml, 21 minute Presiunea: 180 bari Detecţie: UV 230 nm TIC

50. 2. Analiza unor substanţe anticancerigene şi anti-HIV Taxol, R = CH3 3. Separări chiralice Albendazol sulfoxid (ABZSO) - antihelmintic - Chiralpak AD, eluţie cu 2-propanol - Chiralcel OD, eluţie cu metanol