Download
1 / 54
540 likes | 789 Views
פיתוח תוכנת עיבוד תמונה לניתוח תוצאות ניסויים המבוצעים במערכות Microfluidics לחקר אינטרקציות חלבון- חלבון / חלבון - DNA. מגישים: חגית פיליפ ורונן ביאלסקי מנחה: ד"ר דורון גרבר. סדנה לפרוייקטים המגמה לביולוגיה חישובית אוניברסיטת בר-אילן אוגוסט 2010. רקע מדעי.
E N D
פיתוח תוכנת עיבוד תמונה לניתוח תוצאות ניסויים המבוצעים במערכות Microfluidics לחקר אינטרקציות חלבון-חלבון / חלבון-DNA מגישים: חגית פיליפ ורונן ביאלסקי מנחה: ד"ר דורון גרבר סדנה לפרוייקטים המגמה לביולוגיה חישובית אוניברסיטת בר-אילן אוגוסט 2010
רקע מדעי מדוע חוקרים אינטרקציות חלבון-חלבון וחלבון-DNA? • נושא מרכזי בביוכימיה, בחקר מעבר אותות, חקר רשתות בקרה • תהליכים ביולוגיים רבים מאוד מבוססים על אינטרקציות בין חלבונים • חלבונים קושרי DNA: פקטורי שעתוק, פולימראזות, נוקלאזות • הבנת האינטרקציות חיונית בביולוגיה מערכתית ולבניית מודלים של התא
רקע מדעי פיתוח אנטיביוטיקות חדשות ו"מלחמה" בוירוסים וירוסים משתמשים ברשתות אינטראקציה מורכבות מאוד ליצירת ממשק עם המארח ולחטיפת ה-machinery שלו כדי שיבצע את "מבוקשם". הוירוסים משפיעים על רשתות המארח ברמות הגנום, הטרנסקריפטום והפרוטאום. על ידי מיפוי רשתות האינטראקציה של חלבונים ויראליים עם המארח, ניתן יהיה לגלות את הממשקים בין וירוסים למארחים שלהם. כיצד נוכל להשפיע או "לכבות" את הממשקים האלה בין וירוסים למארח?
רקע מדעי שיטות לחקר האינטראקציות בין חלבונים והחסרונות שלהן • yeast two-hybrid (Y2H)– לא ניתן להשתמש בשיטה עבור חלבונים ממבראנליים, שיעור גבוה של תוצאות false positive • סינון על בסיס אפיניות עם ספקטרומטריה – פרוצדורות אגרסיביות של שטיפה המשפיעות על רגישות השיטה • שיטות מבוססות microarray – קשה לזהות אינטרקציות חלשות או ארעיות
רקע מדעי מה זה Microfluidics? • תחום העוסק בחקר ההתנהגות ומניפולציה של נפחים זעירים של נוזל - ננוליטרים או פיקוליטרים. • מהיישומים העיקריים של מיקרופלואידיקה הוא מחקר בתחום הביולוגיה המולקולרית, בפרט על ידי שילוב מערכות מיקרופלואידיות עם microarrays. מערכת ה-PING(protein interaction network generator) • פלטפורמת microfludics לביצוע ניסויים מרובי תפוקה in vitro לאיתור אינטראקציות בין חלבונים. • מערך שעל גבי כל תא שלו הודפסו 2 מולקולות DNA, המכיל תבנית המקודדת לחלבונים, מיושר ומחובר עם המתקן המיקרופלואידי. • סינתזת חלבונים in vitro על הצ'יפ, יחד עם מבחן אפיניות • מיקרופלואידי in situ. • מדידת אינטראקציות ללא איבוד ה"פתיון" (prey) בעקבות שטיפות, • יכולה לזהות אינטראקציות חלשות או ארעיות בין חלבונים.
רקע מדעי שלבי הניסוי במערכת ה-PING • על פני אזור מעגלי שבתוך כל תא (chamber) שמים נוגדן אשר מזהה את חלבון ה"פתיון". • מבטאים חלבונים in vitro על ידי מילוי כל תא עם מיצוי של E. Coli, המאפשר שעתוק ותרגום של ה-DNA שהודפס. • מודדים אינטראקציות בין "פתיון" ל"חכה" על ידי נוגדנים מסומנים פלורוסנטית.
רקע מדעי יתרונות השיטה • על גבי מתקן יחיד ניתן לבטא אלפי קומבינציות של חלבונים, ללא צורך בטיהור (purification) או יידע מוקדם לגבי המצב האוליגומרי של החלבון. • ביטוי חלבונים in vitro מונע סיבוכים הנגרמים בגלל החיוּת והפיזיולוגיה של תאים, PING מאפשרת מדידה ביופיזיקלית ישירה של אינטראקציות עבור חלבונים שונים. • כל תגובה מתרחשת בתא נפרד - אין מגבלות הנובעות כתוצאה מ"זיהום סביבתי" (cross-contamination) או דיפוזיה.
מטרות הפרוייקט התוצאות המתקבלות מניסויי microarray: PING (microfluidics) • עוצמת האור בכל תא מעידה על חוזק האינטראקציה בין 2 החלבונים שנמצאים בו. • כל ניסוי מכיל אלפי זוגות חלבונים. • תוכנה המנתחת את המידע המתקבל מניסויים אלה. Microarray
מטרות הפרוייקט מדוע לא ניתן להשתמש בתוכנות קיימות? התמונות המתקבלות מניסויים בשיטת PING הן בעלות אופי מיוחד: • נקודות האור בתמונה מופיעות בגדלים שונים
מטרות הפרוייקט מדוע לא ניתן להשתמש בתוכנות קיימות? התמונות המתקבלות מניסויים בשיטת PING הן בעלות אופי מיוחד: 2. טבעת אפלה
מטרות הפרוייקט יצירת תוכנה שיודעת: • לאתר את אזורי התגובה בתמונה. • להוציא את המידע המספרי עבור אזורי התגובה. • ליצור טבלה המכילה את המידע לגבי עוצמות האור שנאספו מאותם אזורים.
שיטות קלט התוכנית: 2 קבצי תמונה מסוג TIF – קובץ עבור כל ערוץ קריאה באורך גל מסוים (ערוץ ירוק וערוץ אדום) פלט התוכנית: טבלת אקסל שבה מפורטות עוצמות האור של הנקודות שבתמונות פיתחנו את התוכנית ב-MATLAB
שיטות התמונה המקורית:
שיטות לאחר יצירת הגריד:
שיטות לאחר מחיקת העיגולים הגדולים:
שיטות תחילה אנו מגבירים את ניגודיות התמונה, כך שהנקודות יהיו ברורות יותר.
שיטות לאחר מכן אנו מפעילים את פונ' ה-edge detection של matlab.
שיטות הסרה של נקודות בודדות
שיטות מילוי חורים (במידה ויש לנו צורה סגורה, אנו "ממלאים" אותה)
שיטות מחיקה של תאים שרוב השכנים שלהם (5 ומעלה) שחורים גם כן.
שיטות ביצוע תהליך של "סחיפה". תהליך זה מתרחש באופן הבא: עבור תא מסוים, מסתכלים על 2 שכניו ולוקחים את הערך המינימאלי מביניהם (ניתן לעשות את אותו התהליך אך לקחת את הערך המקסימאלי). ערך זה יהיה הערך החדש של התא עליו עבדנו. באופן זה אנו בעצם מוחקים את כל התאים שאין להם 2 שכנים לבנים.
שיטות תהליך ניקוי אחרון ו.. סיימנו! התקבלה תמונה מושלמת! כמעט.. טוב נו.. אף אחד לא מושלם..
