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PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE POLIPÉPTIDOS Y PROTEÍNAS MEDIANTE RMN

PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE POLIPÉPTIDOS Y PROTEÍNAS MEDIANTE RMN.

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PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE POLIPÉPTIDOS Y PROTEÍNAS MEDIANTE RMN

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Presentation Transcript

  1. PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE POLIPÉPTIDOS Y PROTEÍNAS MEDIANTE RMN • Una vez realizada la asignación, en ausencia de la estructura tridimensional de alta resolución, la información que proporciona la RMN permite estimar con mucha exactitud la estructura secundaria de la cadena polipeptídica. • Existen varias fuentes de información sobre la estructura secundaria: • Los desplazamientos químicos. • Las constantes de acoplamiento, 3J(HN-H). • La protección de los H amida frente al intercambio con deuterio. • Los patrones de NOEs característicos de estructuras secundarias.

  2. El INDICE DE DESPLAZAMIENTO QUÍMICO CSI (Chemical Shift Index) El desplazamiento químico de los núcleos de la cadena principal polipeptídica es bastante sensible a los ángulos diedros  y de la cadena y, por tanto, contiene información sobre la estructura secundaria. Los núcleos más sensibles son: H , C , C y CC=O. La figura muestra las distribuciones de los desplazamientos químicos de los H observados en hélices  y láminas  en una serie de proteínas de estructura conocida. Los desplazamientos químicos de H son: -Hélices : 0.39 ppm menores que los típicos de cadenas desordenadas (random coil). -Láminas : 0.37 ppm mayores que los típicos de random coil. Wishart, Sykes & Richards. J Mol Biol (1991) 222, 311.

  3. El INDICE DE DESPLAZAMIENTO QUÍMICO CSI (Chemical Shift Index) Se define el índice de desplazamiento químico (CSI) como un número entero (+1, 0 , -1) que se asigna a cada residuo de la cadena según sea la diferencia entre el desplazamiento químico real del H y el desplazamiento químico típico para una conformación “random coil” que se da en la Tabla siguiente: Wishart et al. (1992) Biochemistry 31, 1647 Si (H) - (H)r.coil > 0.1 ppm CSI = +1 Si (H) - (H)r.coil está dentro de  0.1 ppm CSI = 0 Si (H) - (H)r.coil < - 0.1 ppm CSI = -1

  4. CSI residue # CRITERIOS PARA IDENTIFICACIÓN DE ESTRUCTURA SECUNDARIA: • Una agrupación densa de 4 ó más valores de CSI = -1 (>70% no cero) no interrumpidos por CSI = +1 se asigna a hélice . • Una agrupación densa de 4 ó más valores de CSI = +1 (>70% no cero) no interrumpidos por CSI = -1 se asigna a una hebra . • Otras regiones se asignan a giros, lazos o zonas desordenadas (coil). La exactitud del método es del 90-95%.

  5. DESPLAZAMIENTOS QUÍMICOS DE OTROS NUCLEOS Para la identificación de la estructura secundaria también se pueden usar los desplazamientos químicos de C , C y CC=O.

  6. CONSTANTES DE ACOPLAMIENTO Y ÁNGULOS DIEDROS Las constantes de acoplamiento 3J entre 1H vecinales están relacionadas con el ángulo diedro  a través de los tres enlaces HCCH mediante la ecuación de Karplus: 3J = Acos2q + Bcosq + C A, B y C son constantes ajustables empíricamente.

  7. RELACIONES DE KARPLUS EMPÍRICAS EN PROTEÍNAS Las constantes de acoplamiento 3J pueden medirse y compararse con los ángulos diedros que se observan en las estructuras de rayos X de diversas proteínas. Así se han podido calibrar los parámetros empíricos de las relaciones de Karplus. Constantes de acoplamiento 3JHNH en función de los ángulos f para BPTI 3JHN-Ha(f)= 6.4 cos2(f - 60°) -1.4 cos(f - 60°) + 1.9 Existen otras relaciones empíricas para otros ángulos diedros

  8. CONSTANTES DE ACOPLAMIENTO 3JHN-H EN PROTEÍNAS Según la relación de Karplus anterior, para estructuras secundarias regulares los valores de 3JHNH son: -Hélice  ( = 57º): 3JHNH = 3.9 Hz -Hélice 310 ( = 60º): 3JHNH = 4.2 Hz -Lámina  antiparalela ( = 139º): 3JHNH = 8.9 Hz -Lámina  paralela ( = 119º): 3JHNH = 9.7 Hz Generalmente se adoptan los criterios siguientes para identificar la estructura secundaria: -Segmentos de 3 ó más residuos con 3JHNH < 6 Hz → Hélices - 3JHNH 6-8 Hz → Extendida o random -Segmentos de 3 ó más residuos con3JHNH > 8 Hz → Láminas  Pueden ocurrir desviaciones debidas a la presencia de prolinas.

  9. MEDIDA DE CONSTANTES DE ACOPLAMIENTO Las constantes de acoplamiento son importantes por que proporcionan información estructural. Tradicionalmente, las constantes de acoplamiento se venían midiendo en el espectro 2D-COSY, a partir del análisis de los multipletes en antifase. 3JHNH Experimental Simulado Problemas: Solapamiento, cancelación de componentes en antifase, sobreestimación. Se han desarrollado gran variedad de métodos para medirlas de forma precisa. -RMN homonuclear: E.COSY, PE.COSY. -RMN heteronuclear: 15N-TOCSY-HMQC, 3D HNHA.

  10. O R O R C CH C CH D2O … … … … CH CH N N R R D H PROTECCIÓN FRENTE AL INTERCAMBIO H-D Las cadenas polipeptídicas intercambian rápidamente sus hidrógenos amida con el disolvente. El intercambio se puede observar registrando espectros de RMN inmediatamente después de disolver la muestra en D2O y observando cómo desaparecen las señales de los HN al ser sustituidos por deuterios. Si un HN se encuentra implicado en un puente de hidrógeno estable en una estructura secundaria el intercambio se hace muy lento. Se dice que está protegido frente al intercambio. Así, mediante la observación de qué residuos intercambian sus HN lentamente se puede obtener información sobre la estructura secundaria.

  11. PROTECCIÓN FRENTE AL INTERCAMBIO H-D En las estructuras secundarias regulares de las proteínas todos los HN están formando parte de puentes de hidrógeno excepto: -Los 4 primeros residuos de las hélices . -Los 3 primeros residuos de las hélices 310. -Cada segundo residuo de las hebras periféricas en láminas . Si un HN está protegido significativamente del intercambio es muy probable que forme parte de algún elemento de estructura secundaria como donor en un puente de hidrógeno. Sin embargo, con sólo esta información no se puede identificar al residuo aceptor en el puente de hidrógeno. Es necesaria información adicional que se obtiene de los patrones característicos de NOEs.

  12. PATRONES CARACTERÍSTICOS DE NOEs Cada tipo de estructura secundaria presenta unas distancias características entre núcleos. Los patrones de NOEs que se han descrito en la asignación secuencial proporcionan información sobre la estructura secundaria de la cadena. Combinados con la información del intercambio H-D, las constantes de acoplamiento 3JHN-H y los CSI, permiten predecir con bastante exactitud la estructura secundaria.

  13. K1 T2 L3 T4 L5 E6 A7 A8 L9 R10 N11 A12 W13 L14 R15 E16 V17 G18 L19 K20 dN(i,i+1) dN(i,i+1) dNN(i,i+1) dN(i,i+2) dN(i,i+3) dNN(i,i+2) d(i,i+3) ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL PEPTIDO PROBLEMA. Coil Coil Hélice 

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