1 / 72

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Cz ęść 2: Badania strukturalne białek

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Cz ęść 2: Badania strukturalne białek. Badanie struktury białek Budowa białek Przesunięcia chemiczne w białkach Więzy NMR Ogólna strategia wyznaczania struktur białek Małe białka NOE - odległości H…H

holden
Download Presentation

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Cz ęść 2: Badania strukturalne białek

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 2: Badania strukturalne białek

  2. Badanie struktury białek • Budowa białek • Przesunięcia chemiczne w białkach • Więzy NMR • Ogólna strategia wyznaczania struktur białek • Małe białka • NOE - odległości H…H • Stałe sprzężenia spinowego - kąty dwuścienne • Średnie białka • Wielowymiarowe korelacje heterojądrowe • Widma NOESY redagowane izotopowo • Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe • Resztkowe sprzężenia dipolowe • Duże białka • Deuterowanie i TROSY A. Ejchart, Wiadomości Chemiczne, 2005, 59, 23-45.

  3. Budowa białek Podstawowe aminokwasy naturalne wchodzące w skład białek.

  4. Budowa białek Łączenie aminokwasów w łańcuch polipeptydowy: struktura pierwszorzędowa Konformację głównego łańcucha polipeptydowego określają kąty , , .

  5. Budowa białek Elementy struktury drugorzędowej helisy, b-kartki, zgięcia, są stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Typowe wiązania wodorowe w białkach[Ǻ] hydroksyl-hydroksyl: OHOH 2,80,1 Ǻ hydroksyl-karbonyl: OHO=C 2,80,1 Ǻ amid-karbonyl: >NHO=C 2,90,1 Ǻ amid-hydroksyl: >NHOH 2,90,1 Ǻ amid-azot imidazolowy: >NHN 3,10,2 Ǻ amid-siarka: >NHS 3,70,2 Ǻ

  6. Budowa białek Struktura drugorzędowa helisy 310: CO(i)···HN(i+3) a: CO(i)···HN(i+4) p: CO(i)···HN(i+5)

  7. Budowa białek Struktura drugorzędowa b-kartki (b) antyrównoległa 3-niciowa b kartka (c) równoległa 3-niciowa b kartka

  8. Budowa białek Przykład – białko S100A1 budowa pierwszorzędowa, budowa drugorzędowa, budowa trzeciorzędowa, budowa czwartorzędowa.

  9. Czynniki utrudniające wykorzystanie NMR

  10. Rybonukleaza (124 reszty, 15 mM, B0 =0,94 T {40 MHz}) M. Saunders, A. Wishnia, J.G. Kirkwood, J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 3289. Lizozym (129 reszt, 1 mM, B0 = 17,6 T {750 MHZ}) J.N.S. Evans, Biomolecular NMR Spectroscopy, Oxford University Press, 1995, str.4

  11. Typowe zakresy przesunięć chemicznych w białkach 1H: przypisania – bardzo ważne HN NOE – bardzo ważne Hb, Hg, … 13C: przedziały C' i Ca są odległe d(15N) amidy w łańcuchu głównym oraz łańcuchach bocznych Asn , Gln i Trp: 105 – 130 ppm.

  12. Przypisanie sygnałów w widmach izotopów 1H i 13C pozwala • na identyfikację obszarów obejmujących struktury drugorzędowe • w oparciu o podejście statystyczne wykorzystując: przesunięcia chemiczne w modelowych peptydach • i białkach o znanych strukturach - CSI, D.S. Wishart et al., J. Biomol. NMR, 5, 67-81 (1995) przesunięcia chemiczne w białkach o znanych strukturach krystalograficznych - TALOS, TALOS+ G. Cornilescu, F. Delaglio, A. Bax, J. Biomol. NMR, 13, 289-302 (1995) Y. Shen, F. Delaglio, G. Cornilescu, A. Bax, J. Biomol. NMR,44, 213-223 (2009) • PREDITOR M.V.Berjanskii, S. Neal, D.S. Wishart, Nucl. Acids Res.,34, W63-W69 (2006) CS23D (struktura trzeciorzędowa) D.S. Wishart, D. Arndt, M.V.Berjanskii, P. Tang, J, Zhou, G. Lin, Nucl. Acids Res.,36, W496-W502 (2008)

  13. CSI - Chemical Shift Index Peptyd wiążący jony wapnia.

  14. Struktura przestrzenna podjednostki dimerycznego białka S100A1 otrzymana z przesunięć chemicznych (CS23D) i wszystkich więzów (X-PLOR) CS23D X-PLOR

  15. Przestrzenna (3D) struktura cząsteczki zbudowanej z N atomów jest całkowicie zdefiniowana przez (3N - 6) wpółrzędnych wewnętrznych: - odległości międzyatomowe (zwykle długości wiązań), - kąty pomiędzy wiązaniami, - kąty dwuścienne. Długości wiązań i kąty walencyjne są tymi parametrami strukturalnymi, które zwykle charakteryzują się małymi zmianami wartości.

  16. Jakie więzy można otrzymać przy pomocy NMR? •  Odległości pomiędzy protonami: • W1: jądrowy efekt Overhausera (NOE). •  Kąty dwuścienne: • W2: wicynalne sprzężenia spinowe (3J). •  Odległości pomiędzy donorem i akceptorem • w wiązaniu wodorowym: • W3: sprzężenia skalarne (nhJ). •  Orientacja wektorów międzyjądrowych • w molekularnym układzie współrzędnych: • W4: resztkowe sprzężenia dipolowe (d). •  Wzajemna orientacja wiązań: • informacyjnie:interferencja mechanizmów relaksacji (G). Więzy NMR są niejednoznaczne !

  17. W1 NOESY - odległości pomiędzy protonami Intensywność sygnału korelacyjnego w widmie NOESY zależy od odległości pomiędzy oddziałującymi jądrami: I ~ dij-6 i szybko maleje z odległością. • Warunki dokładnego wyznaczenia odległości: • znajomość odległości kalibracyjnej I1/I2~ (d1/d2)-6, • izotropowa reorientacja dyfuzyjna cząsteczki, • wyeliminowanie dyfuzji spinowej (krótkie czasy mieszania), • sztywna struktura (brak ruchów segmentowych czy lokalnych).

  18. W1 NOESY - odległości kalibracyjne • Jako niezmienne, znane odległości pomiędzy protonami można wybrać: • odległości pomiędzy protonami geminalnymi, d  1,8 Å, • odległości pomiędzy protonami w resztach aromatycznych • np. pomiędzy protonami Hd i He w tyrozynie, d  2,5 Å. NOESY - reorientacja dyfuzyjna cząsteczki Przy anizotropowej reorientacji cząsteczki, wektory HH różniące się kierunkami są scharakteryzowane przez różne czasy korelacji. dyfuzja spinowa

  19. W1 NOESY - dyfuzja spinowa Liniowy układ sześciu spinów: zakł.  1  2  3  4  5  6

  20. W1 NOESY - ruchy konformacyjne Odległość otrzymana z NOE przy uśrednieniu pomiędzy dwoma konformerami o równych populacjach i odległościach H…H: r1 = 2 Å oraz r1 = r2. Przykład: szybkie uśrednienie dwóch konformacji, w których odległości H…H wynoszą 2 Å i 4 Å przy założeniu jednej sztywnej konformacji odpowiada d=2,4 Å.

  21. W2 Wicynalne sprzężenia skalarne - kąty dwuścienne Zależność Karplusa: 3J(F) = A·cos2F + B·cosF + C Mankamenty tego rodzaju więzów: konieczność kalibracji, niejednoznaczność zależności Karplusa. Przykład: jeden z kątów szkieletu białka - . Projekcja Newmana dla  = 0.

  22. W2 Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne Doświadczalne zależności dla homo- i heterojądrowych sprzężeń w białkach zależne od kąta dwuściennego . Konieczne znakowanie izotopowe.

  23. W2 Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne Pomiar homojądrowego sprzężenia spinowego w białku znakowanym 15N.

  24. W3 Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe h3JNC’: -0,2 do -0,9 Hz kartka b -0,65 ± 0,14 Hz helisa a -0,38 ± 0,12 Hz h2JHC’: -0,6 do 1,3 Hz h3JHCa: 0 do 1,4 Hz Niezbędne jest znakowanie izotopowe 15N/13C

  25. W3 Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe s, i - niestłumione korelacje sekwencyjne i intrarezydualne

  26. W4 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC W środowisku izotropowym oddziaływania dipolowe uśredniają się do zera. Jedynym ich przejawem jest obecność jądrowego efektu Overhausera - NOE. W środowisku anizotropowym, wymuszającym częściowe uporządkowanie cząsteczek, pojawiają się resztkowe sprzężenia dipolowe. Ich wielkość zależy od stopnia uporządkowania, ilościowo opisanego przez tensor uporządkowania A. Orientacje wektorów określających oddziaływanie dipolowe danego typu są zdefiniowane w w tym samym układzie osi własnych tensora A dla całej cząsteczki. RDC stanowią więzy dalekozasięgowe

  27. W4 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC Metody orientowania białek w roztworach Białka paramagnetyczne Wykorzystanie fazy nematycznej (bicelle, fagi, krystality celulozy) Purpurowa membrana (bakteriorodopsyna) Ściśnięty żel poliakrylamidowy bicelle fagi

  28. W4 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC RDC = DAX·[DAa·(3cos2q 1) + 1.5·DAr·sin2q·cos2f] DAX = m0gAgXh/16p3rAX3 [Hz] DAa = Azz - (Axx Ayy)/2, DAr = Axx Ayy D – stała sprzężenia dipolowego, A – tensor uporządkowania. DNH: -24 kHz DCH: 47,9 kHz DHH: 10 - 22 kHz Przykładowe sprzężenia dipolowe

  29. W4 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC Fragmenty widm 1H,15N HSQC dla białka S100A1 znakowanego 15N mierzone wśrodowisku izotropowym oraz w roztworze zawierającym bicelle. izotropowy anizotropowy

  30. Ogólna strategia wyznaczania struktur białek 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

  31. Postępowanie przy wyznaczaniu struktur białek

  32. Ważne obszary korelacji homojądrowych 1H/1H fingerprint region

  33. Widmo TOCSY heksadekapeptydu; fingerprint region. Identyfikacja sygnałów należących do poszczególnych reszt i podział według topologii układu spinowego. Asp1-Lys2-Asp3-Gly4-Asp5-Gly6-Tyr7-Ile8-Ser9-Ala10-Ala11-Glu12-Ala13-Ala14-Ala15-Gln16

  34. Korelacje izoleucyny Hd (0,76) Hg2 (0,86) d(C)=13,1 Hg1 (1,57) Korelacja 1H/13C Hb (1,83) d(C)=17,7 d(H)=0,86 Pierwotne przypisanie d(Hd,Ile) = 0,76 było błędne. d(H)=0,76 d(C)=27,2 Ha (4,47) HN (9,53) HN–CaH(COO)–CbH(Cg2H3) –Cg1H2–CdH3

  35. Asp1-Lys2-Asp3-Gly4-Asp5-Gly6-Tyr7-Ile8-Ser9-Ala10-Ala11-Glu12-Ala13-Ala14-Ala15-Gln16Asp1-Lys2-Asp3-Gly4-Asp5-Gly6-Tyr7-Ile8-Ser9-Ala10-Ala11-Glu12-Ala13-Ala14-Ala15-Gln16 Widmo NOESY heksadekapeptydu, obszar HN/HN. Przypisania sekwencyjne: sekwencja Lys2 - Tyr7, sekwencja Ala10 - Gln16.

  36. Dla białek większych niż 10 kDa widma 2D NOESY stają się nieczytelne. Fragment widma 2D NOESY interleukiny 1b (17,4 kDa). G.M. Clore, L.E. Kay, A. Bax, A.M. Gronenborn Biochemistry, 30, 12-18 (1991).

  37. Wielowymiarowa spektroskopia NMR Homo- czy heterojądrowe techniki NMR ? - Do pomiarów heterojądrowych konieczne jest wzbogacenie izotopowe 15N/13C. - Czułość sekwencji heterojądrowych 3D jest większa niż homojądrowych 3D i porównywalna z czułością sekwencji homojądrowych 2D. - Przeniesienie koherencji jest wydajne wtedy, gdy szerokości połówkowe sygnałów nie są większe niż stałe sprzężenia skalarnego. Korelacje homojądrowe: J(HH)<18 Hz. Korelacje heterojądrowe: J(CH)<120 Hz, J(NH)90 Hz. - Liczba sygnałów w widmach homojądrowych szybko rośnie z liczbą wymiarów zwiększając stłoczenie i zmniejszając czułość, zaś w widmach heterojądrowych pojawiają się jedynie specyficzne sygnały korelacyjne. - Przesunięcia chemiczne heterojąder zwiększają rozproszenie sygnałów.

  38. W widmach korelacyjnych do przeniesienia magnetyzacji wykorzystuje się sieć sprzężeń spinowych 1J i 2J, które zazwyczaj mają duże wartości. Znakowanie, oprócz zwiększenia czułości pomiaru, tworzy sieć aktywnych magnetycznie heterojąder co umożliwia przenoszenie magnetyzacji wzdłuż szkieletu białka.

  39. Dlaczego większość widm NMR białek mierzy się w H2O ? Podwójnie znakowane 15N/13C-S100A1 30 min po rozpuszczeniu tydzień po rozpuszczeniu Rozpuszczalnik H2O Rozpuszczalnik D2O

  40. Schemat Hexc→X→Hdet można realizować na dwa sposoby "out and back" oraz "one way" transfer nazewnictwo one way out and back one way: Ha→Ca(t1)→N(t2)→HN(t3); (H)CANNH out and back: HN→N→Ca(t1)→N(t2)→HN(t3); HNCA Uwzględniając relaksację schemat "out and back" jest w tym przypadku 4 razy czulszy

  41. Przypisania sygnałów łańcucha głównego Podstawowe widmo: 2D 1H-15N HSQC koreluje: Ni, HNi Przykład: białko holo-S100A1, tionylowane homocysteiną na Cys85, 2*93 reszty aminokwasowe, m.cz. 21 kDa. Dalsze dane widmowe dla tego samego białka.

  42. Przypisania sygnałów łańcucha głównego 1J(NiC'i-1) = 15 Hz; 2J(NiC'i) ≈ 0 Hz 1J(NiC'ai) = 11 Hz; 2J(NiC'ai-1) = 7 Hz d(C'): 170-185 ppm; d(Ca): 40-70 ppm Wartości stałych J prowadzą do par widm korelacyjnych HN(CO)CA: Ni, HNi, Cai-1; HNCA: Ni, HNi, Cai, Cai-1

  43. Przypisania sygnałów łańcucha głównego HN(CO)CA: Ni, HNi, Cai-1 HNCA: Ni, HNi, Cai, Cai-1

  44. Przypisania sygnałów łańcucha głównego HNCO: Ni, HNi, C'i-1; (HCA)CO(CA)NH: Ni, HNi, C'i, C'i-1 one way: Ha→Ca→C'(t1)→Ca→N(t2)→HN(t3); (HCA)CO(CA)NH out and back:HN→N→C'(t1)→N(t2)→HN(t3); HN(CA)CO W tym przypadku transfer „one way" jest czulszy niż "out and back". Para widm najbardziej różniących się czułością.

  45. Przypisania sygnałów łańcucha głównego HNCO: Ni, HNi, C'i-1 (HCA)CO(CA)NH: Ni, HNi, C'i, C'i-1

  46. Przypisania sygnałów łańcucha głównego (HBHA)CBCA(CO)NH: Ni, HNi, Cai-1, Cbi-1 (one way) HNCACB: Ni, HNi, Cai-1, Cbi-1, Ca1, Cbi (out and back) HaHb→CaCb(t1)→C'→N(t2)→HN(t3); (HBHA)CBCA(CO)NH HN→N→CaCb(t1)→N(t2)→HN(t3); HNCACB

More Related