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实验五 聚合酶链式反应检测质粒 DNA

实验五 聚合酶链式反应检测质粒 DNA. 实验目的. 掌握聚合酶链式反应的原理与操作方法 了解 PCR 反应体系的筛选与优化. 实验原理. 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction , PCR ） : 就是在体外通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 设计一对寡聚核苷酸引物与目的 DNA 分子互补，在 DNA 聚合酶的作用下，通过变性、退火和聚合的循环来大量扩增目的 DNA 片段。. 该技术于 1985 年由 Mullis 及其同事共同设计并研究成功，从开车中得到灵感 逶迤崎岖的山路 —— DNA 双螺旋

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实验五 聚合酶链式反应检测质粒 DNA

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Presentation Transcript

  1. 实验五 聚合酶链式反应检测质粒DNA

  2. 实验目的 • 掌握聚合酶链式反应的原理与操作方法 • 了解PCR反应体系的筛选与优化

  3. 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR ）: 就是在体外通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 设计一对寡聚核苷酸引物与目的DNA分子互补，在DNA聚合酶的作用下，通过变性、退火和聚合的循环来大量扩增目的DNA片段。

  4. 该技术于1985年由Mullis及其同事共同设计并研究成功，从开车中得到灵感该技术于1985年由Mullis及其同事共同设计并研究成功，从开车中得到灵感 • 逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋 • 行驶的汽车——一小段DNA引物 • 于1993年获得诺贝尔奖。

  5. 它包括三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; • (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; • (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.

  6. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

  7. PCR反应中的主要成份 • 1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。 • 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) • 3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。

  8. PCR反应中的主要成份 • 4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.

  9. PCR反应中的主要成份 • 5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间 • 6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+

  10. PCR反应参数 • 1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。

  11. PCR反应参数 • 2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。

  12. PCR反应参数 • 3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃. 延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。 • 4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。

  13. PCR反应程序 • 预变性 94 ℃ • 变性（解链） 94 ℃ • 退火 55 ℃ • 延伸 72 ℃ • 体系稳定 72 ℃ 25~35个循环

  14. PCR的主要用途 1、目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。 2、基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。 3、 DNA的微量分析 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析检测。

  15. 实验材料及试剂 PUC18质粒 M13引物——一对F、R Taq聚合酶 酶反应缓冲液Buffer dNTP ddH2O

  16. 移液枪及Tip吸头 • 薄壁微量PCR管（0.2ml） • 基因扩增仪 • 电泳仪及电泳槽 • 高速离心机

  17. 操作步骤 • 反应体系：共10ul • 质粒DNA： 1ul • M13引物F： 1ul • M13引物R： 1ul • Buffer： 2ul • dNTP： 1.5ul • Taq聚合酶： 0.3ul • ddH2O： 3.2ul

  18. 反应程序： • 94℃ 预变性 5min • 94℃ 50s • 55℃ 40s • 72℃ 90s • 72℃ 10min • 4℃ 保存 35个循环

  19. 向扩增产物中加入荧光染色剂，以浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定扩增产物的片段大小。向扩增产物中加入荧光染色剂，以浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定扩增产物的片段大小。

  20. 实验结果 • 1、电泳图谱 • 2、PCR反应优化需考虑的因素有哪些？

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