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第五章 蛋白质工程

第五章 蛋白质工程. 第五章 蛋白质工程. 【 知识目标 】 ① 了解蛋白质工程的产生背景及目前的发展状况。 ②理解蛋白质工程的主要的研究过程及具体操作手段。 ③掌握蛋白质工程的概念并明确其研究的目标。 【 技能目标 】 ① 能够运用蛋白质工程的基本原理解析在实际生产生活中蛋白质工程应用的实例。 ②掌握胰蛋白酶酶活力的测定方法。. 第一节 蛋白质工程概述. 一、蛋白质工程的概念

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第五章 蛋白质工程

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  1. 第五章 蛋白质工程

  2. 第五章 蛋白质工程 • 【知识目标】 • ①了解蛋白质工程的产生背景及目前的发展状况。 • ②理解蛋白质工程的主要的研究过程及具体操作手段。 • ③掌握蛋白质工程的概念并明确其研究的目标。 • 【技能目标】 • ①能够运用蛋白质工程的基本原理解析在实际生产生活中蛋白质工程应用的实例。 • ②掌握胰蛋白酶酶活力的测定方法。

  3. 第一节 蛋白质工程概述 • 一、蛋白质工程的概念 • 根据对蛋白质己知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对现有蛋白质结构基因进行改造，借以改善蛋白质的物理和化学性质，如提高蛋白质的热稳定性、酶的专一性等，或者利用化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行进行修饰和改造，合成新的蛋白质的技术手段，并可以借此对蛋白质的结构与功能的关系进行更加深入的研究。

  4. 第一节 蛋白质工程概述 • 二、蛋白质概述 • （一）蛋白质的组成 • 组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种其中除甘氨酸和脯氨酸外，均属于 L-α-氨基酸

  5. 第一节 蛋白质工程概述 • 二、蛋白质概述 • （二）蛋白质的结构 • 一级结构 • 二级结构 • 三级结构 • 四级结构

  6. 第一节 蛋白质工程概述 • 二、蛋白质概述 • （三）蛋白质结构与功能的关系 • 1.蛋白质一级结构与功能的关系 • (1)相似的结构具有相似的功能 • (2)不同结构具有不同的功能 • 2.蛋白质空间结构与功能的关系 • 空间结构发生改变，其功能活性也必然会随之改变

  7. 第二节 蛋白质工程的研究方法 • 一、蛋白质工程的研究策略 • 研究过程就是通过严格的分子设计，把它定向地改造成一个具有预期的新的特性的蛋白质。一种是对天然蛋白质进行改造；另一种是完全重建一个新的蛋白质。在具体操作中，前者是对天然蛋白质中的少数几个氨基酸残基进行的替换(小改)、分子剪裁(中改)或者局部重建(大改)；后者是从头设计—个全新的蛋白质。我们目前的蛋白质工程研究中主要进行的是“小改”和“中改”。

  8. 第二节 蛋白质工程的研究方法 • 二、改变现有蛋白质的结构 • （一）小改——少数几个氨基酸残基的替换 • 定点突变是目前蛋白质工程研究的主要技术手段。 • （二）中改——分子剪裁 • 分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换一个肽段或一个结构域。

  9. 第二节 蛋白质工程的研究方法 • 三、蛋白质全新设计 • 对蛋白质的全新设计所应用的技术手段是我们前面所提到的“大改”或“从头设计“工作 • 是在人们认识蛋白质、掌握其结构规律并了解其结构功能关系的基础上进行的。同时也是人们更加深入全面认识蛋白质的一个过程，它的目的是人工创造出自然界中不存在的蛋白质分子，使之具有人们所需要的特殊结构和功能，为人类所利用。 • 目前该技术仍处于实验初级阶段。

  10. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 一、胰蛋白酶 • 胰蛋白酶（EC3.4.21.4）是丝氨酸蛋白酶类，它是一条单链肽，由223个氨基酸残基组成，N末端为异亮氨酸。主要作用于精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。

  11. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 一、胰蛋白酶 • 胰蛋白酶极易自溶，自溶产物经层析分离后，会得到4个具有胰蛋白酶活性的片段。通过对N末端残基的分析，表明这些活性产物是由于Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160处发生了断裂而出现的。人们运用了蛋白质工程手段，对Arg117位自溶点进行了缺失突变，最终得到了稳定性明显提高的突变株。

  12. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 二、金属硫蛋白 • 金属硫蛋白(metallothionein,MT)是由微生物和植物产生的金属结合蛋白，是一类富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质，可以通过半胱氨酸的巯基结合大量的金属素，对多种重金属有高度的亲和性。一般由两个大小相近，结构与功能类似的结构域组成，即α-结构域和β-结构域。人们为将含有α-结构域的基因转移到烟草中，成功的获得了对镉，铜，铅等重金属具有较高抗性的工程株。

  13. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 三、人白细胞介素-2 • IL-2是第—个被发现的白细胞介素。天然人白细胞介素-2是一个由133个氨基酸残基组成的多肽，133个氨基酸中共有3个半胱氨酸，其中有一个半胱氨酸（Cys125）以游离方式存在，而另两个半胱氨酸（Cys58和Cys105）缩合成活性所必需的二硫键。

  14. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 三、人白细胞介素-2 • 人们用蛋白质工程中的定位诱变技术将Cys125的密码TGT转换成TCT或GCA，使Cys125转换成丝氨酸或丙氨酸，避免了错误配对的产生。结果不但使IL-2的生物活性不受影响，而且其热稳定性等方面也得到了较明显的改善。工程IL-2目前已被美国FDA批准上市，用于治疗肾细胞瘤。我国卫生部也已经批准了在国内试生产基因工程白细胞介素-2。

  15. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 四、组织纤维蛋白溶酶原激活因子 • tPA能够切割纤溶酶原形成纤溶酶，从而激活纤溶作用(fibrino1ysis)，使血栓溶解。作为一种高效特异性溶血栓药物。优点 :(1)血栓选择性高但几乎不激活循环血液中的纤溶系统，可直接静脉注射；(2)对中毒性休克引起的弥散性血管内凝血疗效显著等。

  16. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 四、组织纤维蛋白溶酶原激活因子 • 利用基因定点诱变技术，改变tPA分子中的某些糖基化氨基酸而减少或避免了糖基化，有效地减缓了它在血浆中被清除的速率，达到了延长其半寿期的目的，临床应用价值得到有效提高

  17. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 五、枯草杆菌蛋白酶 • 枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)是由枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)合成的一种丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶根据来源的不同可分为Carlsberg，E，BL，YaB等多种。

  18. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 五、枯草杆菌蛋白酶 • 枯草杆菌蛋白酶可以催化蛋白质，把蛋白质水解成氨基酸。具有重要的应用价值，被广泛应用在洗涤剂、制革及丝绸工业中，是一种重要的工业用酶。三维结构及编码基因目前已经基本搞清楚，而且配有合适的克隆、表达系统以及准确的定量分析催化活性的方法，因此缺点目前已经可以通过蛋白质工程得到改进

  19. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 五、枯草杆菌蛋白酶 • 对枯草杆菌蛋白酶所做的定点诱变已有400多个，在理论和应用方面均取得了相当大的进展和成功。枯草杆菌蛋白酶早在几十年前就被开发成为商用的纺织品洗涤剂的添加酶，目前仍然是最基本、最重要，也是使用最广泛、最成熟的洗涤用酶。应用定点改造后的枯草杆菌蛋白酶制成的洗涤剂，便可以实现与漂白剂共同使用的目的了。

  20. 第三节 蛋白质工程的应用实例 • 五、枯草杆菌蛋白酶 • 另一方面枯草杆菌蛋白酶在作为蛋白质工程的研究对象过程中，不仅仅使它自身的诸多性能得到了改善；更为重要的是在研究它的过程中，蛋白质工程的研究理论同时也得到了大大的丰富，这为蛋白质工程技术应用于其他酶的研究，尤其是对其他工业酶的性能改造提供了非常珍贵的范例和理论指导。

  21. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 一、实验目的 • 1.掌握胰蛋白酶的基本性质； • 2.学会纯化、结晶胰蛋白酶的基本方法； • 3.能够独立完成胰蛋白酶的活性及比活性的测定。

  22. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 二、实验原理 • 胰蛋白酶可以催化蛋白质的水解，化学键的催化水解活性的敏感性依次为：酯键> 酰胺键> 肽键。可以利用含有这些键中的任一键形的化合物作为底物来测定胰蛋白酶的专一催化活性。 • 本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。

  23. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 三、试剂和器材 • 1.材料 • 新鲜或速冻的猪胰脏 • 2.仪器 • 剪刀、镊子；绞肉机；研钵；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽滤瓶； • 显微镜；纱布；恒温水浴锅；紫外分光光度计；计时器；pH试纸。

  24. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 三、试剂和器材 • 3.试剂 • pH2.5乙酸酸化水；2.5mol/L H2SO4；5 mol/L NaOH； • 2 mol/L NaOH；2mol/L HCl；0.001 mol/L HCl；硫酸铵；氯化钙。 • 0.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液：取20mL 0.8 mol/L硼酸溶液，加80mL 0.2 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。 • 0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用0.8 mol/L稀释1倍即可）； • 0.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液：取70mL 0.2 mol/L硼酸溶液，加30mL 0.05 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。 • 0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液：取50mL 0.1 mol/Ltris（三羟甲基氨基甲烷），加29.2 mL 0.1mol/L HCl ，再加水定容至100mL。 • BAEE底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液中加0.34mgBAEE和2.22mg的氯化钙。

  25. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 四、实验步骤 • （一）猪胰蛋白酶制备 • 1.猪胰蛋白酶原的提取 • 2.胰蛋白酶原激活 • 3.胰蛋白酶的分离 • 4.胰蛋白酶的结晶 • 5.胰蛋白酶的重结晶

  26. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 四、实验步骤 • （二）胰蛋白酶活性的测定 • 以苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物，用紫外吸收法进行测定

  27. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 五、注意事项  • 1.胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或速冻的。 • 2.在室温14～20℃条件下8～12h可激活完全，比活性达到“3000～4000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活。 • 3. 进行结晶时应十分细心地按规定条件操作。 • 4. 必须严格控制PH。 • 5.第一次结晶时，3～5d后仍然无结晶，应检查pH，必要时调整pH，促使结晶形成。

  28. 胰蛋白酶酶活力的测定 • 六、思考题 • 1．提取制备猪胰蛋白酶的过程中，应特别注意哪些因素？ • 2．PH值在制备中起到什么作用？ • 3．影响晶体形成的因素有哪些？ • 4．在测定酶的比活力过程中应注意哪些因素？

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