第二十一章 药品质量控制中的现代分析方法的进展

1. 第二十一章 药品质量控制中的现代分析方法的进展

2. 概况 现代分析方法与技术，为药学的发展提供了适时而有效的辅佐与动力。 色谱及其联用技术： 药学研究－－分子水平。 手性分析： 毛细管电泳及手性色谱技术－－药物研究与质量控制提供了保障。 现代光谱技术： 药物结构鉴定， 微量杂质检定。

3. 第一节 毛细管电泳及其应用 一、定义 • 电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis） • 以此对物质进行分离分析的方法即电泳法

4. 二、发展简史 • 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳实验）。但毛细管电泳技术最早是由瑞典科学家Hjerten 提出的，其广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。 • 国内最早是由竺安教授在1980年提出来的，他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建立了两个研究组。1992年CE开始受到国内广泛重视，发展很快。

5. 高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-13—10-15mol之间，荧光检测可达10-19—10-21mol高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-13—10-15mol之间，荧光检测可达10-19—10-21mol 三. 毛细管电泳的优点 高分辨：峰分离效率超过1百万理论塔板数，一般可达几十万。 1、高灵敏度 2、高分辨 3、速度快 4、进样少 5、成本低 速度快：许多分析在几秒至30分钟内完成。 成本低：一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。 进样少：一般需要毫微升的进样量。

6. 分离模式：（一）毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis ，CZE 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流 >ν电泳,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 最基本、应用广的分离模式；

7. （二）胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 在电场力的作用下，胶束在柱中移动。

8. 2. 电泳流和电渗流的方向相反， 且ν电渗流 > ν电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动； 3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围； 5.色谱与电泳分离模式的结合。

9. （三）毛细管凝胶电泳 • （capillary gel electrophoresis,CGE) • （四）毛细管等速电泳 • （capillary isotachor-phoresis,CITP) • （五）毛细管等电聚焦电泳 • （capillary isoelectric focusing,CIEF) • （六）毛细管电色谱（ • capillary electrochromatography,CEC) • （七）微芯片毛细管电泳 • （microchip electrophoresis)

10. 应用与进展 • 毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等

11. 1、离子分析analysis of ion 阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致； 4.5min内分离了24种金属离子； 阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；

12. 2、药物分析analysis of pharmaceutics 检测体液或细胞中某些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段； 采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；

13. 采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法

14. 3、手性化合物分析analysis of chiral compounds HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂； 形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率； 常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）

15. 4、氨基酸与蛋白质分析analysis of amino acids 采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪； 问题：吸附和检测；

16. 蛋白质分析

17. 5、核酸分析及DNA排序analysis of nucleic acids and sequenceof DNA 重要分析手段； 酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；

18. CE和HGP • 目前，人类基因测序已基本完成，人类基因组计划进入后基因组时代。但是，耗资巨大的HGP至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。

19. CE应用举例---肽的分析 CZE 酶切 蛋白质 肽片段混合物 特征性肽图 分离 微量制备 CE 整个蛋白质 的一级结构 分别测定各片段的氨基酸序列

20. 6、新进展advances and special topics 1）微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m； 2）联用仪器 CE-MS； 3）阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序； 5～10万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度！ 100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支

21. 第二节 超高效液相色谱及其应用UPLC

22. 超高效液相色谱的发展 站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。 因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。

23. 超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以下几个方面的进步：　（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现；　（2）超高压输液泵的使用；　（3）高速采样速度的灵敏检测器；超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以下几个方面的进步：　（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现；　（2）超高压输液泵的使用；　（3）高速采样速度的灵敏检测器；

24. （4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术 （5）仪器整体系统优化设计：色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。

25. 超高效液相色谱的优点 分析速度快 灵敏度高 分离度好

26. 2. toluene - 0.088 5. hexylbenzene - 0.360 3. propylbenzene - 0.137 4. butylbenzene - 0.182 1. Thiourea - 0.046 UPLC的速度提高了！ UPLC™ HPLC 0.24 样品的组份数：5 5µm颗粒度 完全分离时间：6.00分钟 0.20 0.16 2. toluene - 1.034 3. propylbenzene - 1.742 4. butylbenzene - 2.413 AU 0.12 1. Thiourea - 0.430 0.08 5. hexylbenzene - 5.058 0.04 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 UPLC™ 样品的组份数：5 1.7µm颗粒度 完全分离的时间：0.60分钟 增加了样 品的通量 0.20 0.10 AU 0.00 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 Minutes

27. 0.050 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 0.00 1.00 2.00 3.00 Minutes 0.040 0.030 AU 0.020 5.0 µm 0.010 0.000 0.050 0.040 0.030 AU 0.020 1.7 µm 0.010 0.000 0.024 0.020 0.016 AU 0.012 0.008 0.004 0.000 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 Minutes 恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！ 恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！ 可看到更多 的样品信息 使用1.7µm颗粒度的填料增加灵敏度

28. Ultra Performance LC™ 速度、灵敏度与分离度的结合 5.0 µm 1.7 µm 60% 更快 30% 更灵敏 70% 更高分离度 0.050 0.040 0.030 AU 0.020 0.010 0.000 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 15.00 Minutes 0.050 0.040 0.030 AU 0.020 0.010 0.000 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Minutes 在改进获得信息质量的前提下提高分析速度

29. Ultra Performance LC™ 速度、灵敏度与分离度的结合 生产力：每次实验得到更多信息 HPLC 3.5µm AU UPLC™ 1.7µm AU 对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度

30. 2.理论基础 • 在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简化表达式： • 如果仅考虑固定相的粒度对的影响，其简化方程式可表达为：

31. 更小的颗粒度…… van Deemter 曲线带来的承诺 如果填料的颗粒继续演变……

32. 填料颗粒尺寸的演变 0.80 0.00 0.20 0.40 0.60 1.00 0.040 Minutes 0.020 AU 0.000 一分钟以内！ 前景： 2.1×100mm色谱柱 1.7µm杂化填料颗粒 可达到15,000psi 通常有每米200,000理论塔板数的柱效 速度、灵敏度及 分离度的完美结合

33. 3.UPLC仪器介绍 • 检测器： • 光学及/或质谱检测器 • 可调紫外或光电二极管矩阵； 为UPLC™专门优化的流动池； 高速检测 • 色谱柱管理： • 创新的枢轴转动设计 • 置色谱柱出口直接到检测器 • 样品管理器： • 低扩散XYZZ’形式 • 快速进样周期 • 低交叉污染 • 样品盘及/或样品瓶 • 可选样品组织器 • 两元溶剂管理： • 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力

34. 3.1 超高效液相色谱的C18色谱柱 • 固定相粒度直径可达1.7µm • 色谱柱长可达3-5cm

35. 3.1.1 色谱柱颗粒化学 改善了高pH稳定性 改善了硅胶的柱效和反压 改善了低pH稳定性 在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的1.7µm颗粒 三官能团键合C18配体

36. 3.1.2 色谱柱硬件

37. 筛板、柱管和连接件，可在超过140MPa压力下装填，保证色谱柱高柱效和长寿命。筛板、柱管和连接件，可在超过140MPa压力下装填，保证色谱柱高柱效和长寿命。

38. 可记录进样次数、最大反压及温度 • 智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历史文件 • 信息不可删除 • 含有该色谱柱独特的分析证书 eCord 装置

39. 3.2 超高效液相色谱的输液系统

40. 3.2.1 二元溶剂管理系统 • 高压混合 • 二元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • 耐高压

41. 3.2.2 UPLC超高压输液泵的特性 与普通HPLC的高压梯度系统相比，UPLC的梯度性能极佳 当梯度陡度为1%，梯度范围为90%-100%时，超高压输液泵的梯度运行曲线

42. UPLC的重现性 其精确度、可靠的梯度性能与HPLC的重现性不相上下 UPLC 34次进样分析烷基芳酮混合物保留时间的重现性

43. UPLC的耐受性 0.35 0.30 0.25 0.20 AU 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 Minutes 稳定性试验的条件： 从10到90%甲醇的1分钟梯度1000次进样 温度：55ºC 最大压力：8500psi 流速：1.3ml/min. ACQUITY UPLC™ C18色谱柱 2.1×30mm 1.7µm 黑色：第一次进样 红色：第1000次进样

44. 3.3 超高效液相色谱的高速检测器 UPLC光导检测器流通池示意图

45. 采样速度快 能减少谱带扩展以保持柱效 灵敏度比HPLC提高2-3倍 流通池体积小、池壁全折射而不损失光能量

46. 3.4超高效液相色谱的自动进样器

48. 针内针装置 • 减少死体积，降低谱带扩展 • 快速自动取样 • 低扩散、低交叉污染 外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到微量取样（µL取样）

49. 4.1 超高效液相色谱的应用 药物分析如天然产物中复杂组分的分析 生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品 食品分析 如食品中农药残留的检测 环境分析如水中微囊藻毒素的检测 其他 如化妆品中违禁品的检测

50. 高分辨串联质谱QTOF micro 灵敏度高(pg-fg级)和选择性强得到的质谱谱图数据完整、品质高。因而，在天然产物，新药开发，药代研究和蛋白质组学领域的定性、定量分析研究方面占有重要地位。