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Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis

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Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis - PowerPoint PPT Presentation


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Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis. ESTUDIO CLINICO DE LA HEMOSTASIA: INTEGRACION DE FUNCION PLAQUETARIA Y COAGULACION.

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Presentation Transcript
estudio clinico de la hemostasia integracion de funcion plaquetaria y coagulacion
ESTUDIO CLINICO DE LA HEMOSTASIA: INTEGRACION DE FUNCION PLAQUETARIA Y COAGULACION
  • El estado actual del conocimiento de la hemostasia, su regulación y su patología exige incluir el análisis de la función plaquetaria en el estudio de los fenómenos prohemorrágicos y protrombóticos.
  • El desarrollo actual de la citometría de flujo la convierte en una tecnología de elección para ese fin.
  • La disponiblidad de técnicas citométricas en sangre entera potencia el valor diagnóstico y pronóstico de la citometría de flujo en el estudio clínico de la hemostasia.
las diez mejores excusas para no estudiar la funcion plaquetaria por citometria de flujo
LAS DIEZ MEJORES “EXCUSAS” PARA NO ESTUDIAR LA FUNCION PLAQUETARIA POR CITOMETRIA DE FLUJO
  • Los citómetros de flujo son para analizar leucocitos.
  • Las plaquetas son demasiado pequeñas para ser detectadas.
  • Las plaquetas sólo se pueden estudiar en forma de PRP.
  • Las plaquetas se activan con mucha facilidad.
  • No hay marcadores fenotípicos de plaquetas.
  • Hay demasiados marcadores fenotípicos de plaquetas.
  • Pero si en la Hemostasia lo importante es la coagulación...
  • Pero si ya se usa un contador de plaquetas...
  • Pero si ya se usa el agregómetro...
  • Pero si ya las estudian en el Centro de Transfusiones...
estudio completo de la hemostasia ventajas de la citometria en sangre entera
ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA
  • Permite estudiar la función plaquetaria en condiciones cuasi-fisiológicas
  • La manipulación mínima previene la activación artefactual de plaquetas
  • Evita la pérdida potencial de subpoblaciones plaquetarias
  • Requiere pequeños volúmenes de muestra (pocos microlitros de sangre)
  • Permite el análisis simultáneo de plaquetas y otras células sanguíneas
citometria de flujo en el analisis de plaquetas
CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS
  • Hasta ahora, el análisis citométrico de plaquetas más habitual es el de anticuerpos antiplaquetarios:
  • Autoanticuerpos
  • Aloanticuerpos:
    • Inmunofenotipo de HPA-1a
    • Detección de anticuerpos maternos y fetales anti-HPA-1a
    • Analisis de IgG asociadas a plaquetas en trombopenias
    • Analisis de IgG asociadas a plaquetas en aloinmunización
    • Cross-match de plaquetas
citometria de flujo en el analisis de plaquetas1
CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS
  • La función plaquetaria también se puede analizar ampliamente en sangre entera por citometría de flujo
    • Activación plaquetaria in vivo
    • Reactividad plaquetaria in vitro
    • Interacciones plaqueta-plaqueta
    • Interacciones plaquetas-leucocito
    • Interacciones plaquetas-eritrocito
    • Liberación de micropartículas procoagulantes
    • Alteraciones en el recuento de plaquetas
    • Alteraciones en la morfología de la plaqueta
    • Maduración normal y patológica de la plaqueta
    • Monitorización del tratamiento antiagregante
analisis citometrico de la funcion plaquetaria
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

ANALISIS DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

analisis citometrico de la funcion plaquetaria1
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
  • La preparación y el procesamiento de la muestra deben
  • ser cuidadosos para mantener las funciones intrínsecas
  • Las condiciones del análisis citométrico se deben
  • adaptar para acotar la población de plaquetas

RBC

Plaquetas

analisis citometrico de la funcion plaquetaria2
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
  • La extracción debe realizarse en reposo y con el mínimo traumatismo
  • Se recomienda desechar los primeros mL de muestra
  • La sangre entera se debe anticoagular con citrato
  • Las muestras se diluyen (1:100) para minimizar la formación de agregados plaquetarios
  • Se utiliza un anticuerpo monoclonal contra una proteína constitutiva de la superficie de la plaqueta para identificar y seleccionar la población plaquetaria
slide14

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

  • Preparartodos los reactivosnecesarios anticipadamente
  • Dispensar la sangre sobre anticoagulante
  • Diluir la sangre (antes de 30 min) con el tampón adecuado
  • Opciones de ensayo:
    • Fijar  Marcar
    • Activar  Fijar  Marcar
    • Activar  Marcar  Fijar
    • Marcar  Activar  Fijar
    • Marcar y activar simultáneamente  Fijar
  • Diluir en tampón adecuado o fijador
  • Analizar p0or citometría de flujo
slide15
Muestrasfijadas

Ventajas:

Fácil de realizar antes de 30 minutos de la toma de muestra

Mejorestimaciónestática del estado de activaciónplaquetario

Desventajas:

Impideestudiarlasrespuestas de activaciónplaquetaria

Algunosepitopos se puedenalterarpor el fijador

Muestrasfrescas

Ventajas:

Posibilidad de medir la activaciónplaquetariain vivo y la reactividadplaquetaria a variosagonistas

Desventajas:

La preparaciónescríticadebido a la activaciónespontánea de lasplaquetas con el tiempo

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

analisis citometrico de la funcion plaquetaria3
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
  • En ausencia de agonistas exógenos se determina el estado de activación in vivo de las plaquetas circulantes
  • La adición de un agonista permite analizar la reactividad in vitro de las plaquetas circulantes.

+ADP

BASAL

analisis citometrico de la funcion plaquetaria4
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
  • Los agonistas más utilizados para la estimulación de plaquetas son:
      • Agonistas fuertes: Trombina y TRAP
      • Agonistas débiles: ADP, Colágeno, Tromboxano A2
      • Ionóforos de Calcio: Ionomicina, A23187
      • Esteres de forbol: PMA
slide19

Ca2+ en sangre = 10.000 en citosol

STD

Plaqueta en

reposo

gránulos densos

[ Ca2+

= 100nM

[

mitocondrias

gránulos a

Ca2+

GPIIb/IIIa

Plaqueta

activada

Canales específicos

Ca2+

Ca2+

STD

GD

analisis citometrico de la funcion plaquetaria6
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
  • La respuesta plaquetaria se puede estimar con:
      • Anticuerpos monoclonales contra marcadores de activación
      • Fluorocromos específicos de funciones bioquímicas
      • Parámetros morfológicos asociados a cambios funcionales

Contaje

CD62P

slide21

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA

Marcador

Citométrico

Emisión de

Fluorescencia

Parámetro

Cambio detectado

2+

Ca libre citosólico

Aumento reversible

FLUO-3 AM

Aumento reversible

Actina G

Polimerización a Actina F

Falacidina

Aumento reversible

Faloidina

Tamaño

Aumento o

Disminución

Cambios en FS

----

Granularidad

Desgranulación

Cambios en SS

slide22

Mepacrina

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA

Marcador

Citométrico

Emisión de

Fluorescencia

Parámetro

Cambio detectado

Liberación del

contenido

Gránulos densos

(Número)

Disminución

Complejos

gp b/V/IX

(Número)

Disminución

Disminución en

superficie

Anticuerpos

específicos

Complejos

gp IIb/IIIa

(Número)

Aumento en

superficie

Anticuerpos

específicos

Aumento

slide23

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA

Marcador

Citométrico

Emisión de

Fluorescencia

Parámetro

Cambio detectado

Anticuerpos

específicos

contra neoepítopos

Complejos

gp IIb/IIIa

Conformación

alterada

Aumento

Modificación de

la resonancia de

fluorescencia

FRET

Anticuerpos

específicos

simultáneos

Conformación

alterada

Complejos

gp IIb/IIIa

Anticuerpos

específicos

contra ligandos

Unión de

ligandos

Complejos

gp IIb/IIIa

Aumento

Expresión de

LIBS y RIBS

Complejos

gp IIb/IIIa

Anticuerpos

específicos

Aumento

slide24

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA

Marcador

Citométrico

Emisión de

Fluorescencia

Parámetro

Cambio detectado

Fosfolípidos

aniónicos

Aumento

Annexina V

Aumento

Anticuerpos

específicos

contra V y VIIIa

Factores de la

coagulación

Aumento

Aumento

CD62P

(P-Selectina)

Aumento

Anticuerpos

específicos

Aumento

CD63

(gp53)

Anticuerpos

específicos

Aumento

Aumento

slide25

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA

Marcador

Citométrico

Emisión de

Fluorescencia

Parámetro

Cambio detectado

CD107a

Anticuerpos

específicos

Aumento

Aumento

(LAMP-1)

CD 107b

Anticuerpos

específicos

Aumento

Aumento

(LAMP-2)

Aumento

Anticuerpos

específicos

Gp40

Aumento

Anticuerpos

específicos

Aumento

Aumento

CD40L

parametros citometricos de activacion plaquetaria
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
  • Detección de plaquetas activadas in vivo:
  • Objetivos:
    • Detección de plaquetas activadas circulantes
    • Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico
  • Aspectos metodológicos:
    • El análisis se efectúa en sangre completa periférica
    • Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE
    • Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC
    • Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC
analisis citometrico de la activacion plaquetaria
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
  • Detección de plaquetas activadas ex vivo:
  • Objetivos:
    • Determinación de la respuesta a agonistas exógenos
    • Estimación del riesgo protrombótico o prohemorrágico
    • Monitorización de tratamientos antiplaquetarios
    • Caracterización del perfil de activación plaquetaria
  • Aspectos metodológicos:
    • El análisis se efectúa en sangre periférica
    • Activación con agonistas plaquetarios: ADP, trombina, etc.
    • Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE
    • Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC
    • Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC
analisis citometrico de la activacion plaquetaria1

TUBO

MUESTRA

Agonista

CD41-PE

Solución Stop

+

CD62P-FITC

(Tyrode a

+4°C)

0

40µL

None

10µL

+

5µL

2 mL

1

36µL

4µL of 50µM

10µL

+

5µL

2 mL

ADP

2

36µL

4 µL of

10µL

+

5µL

2 mL

100µM

TRAP-6

TIEMPO

10 min

5 min

Análisis en

37°C

37°C

+/- 15 minutos

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

Procedimiento típico de un ensayo de activación plaquetaria

Análisis de la

Activación

ex vivo

Análisis de la activación

in vitro

analisis citometrico de la activacion plaquetaria3
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

Expresión de P-selectina (CD62P):

BASAL

BASAL

+ ADP

Contaje

FS log

CD62P-FITC

+ADP

CD62P-FITC

analisis citometrico de la activacion plaquetaria4
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
  • Inducción de la activación:
  • Objetivos:
  • ·Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico
  • ·Monitorización de tratamientos antiplaquetarios
  • ·Caracterización del perfil de activación plaquetaria
  • Aspectos metodológicos:
  • ·El análisis se efectúa en sangre periférica
  • ·Activación con agonistas específicos
  • ·Identificación con CD41, CD49 o CD61 con PE
  • ·Medida cinética de la liberación de calcio con Fluo-3 o Fluo-4
analisis citometrico de la activacion plaquetaria5
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

Inducción de la activación:

+ADP

analisis citometrico de la funcion plaquetaria7
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
  • Medida de la expresión de superficie procoagulante:
  • Objetivos:
  • Cuantificación de la expresión de fosfatidilserina en la
  • superficie de la plaqueta activada
  • Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación
  • Aspectos metodológicos:
  • El análisis se efectúa en sangre periférica
  • Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5
  • Medida de fosfatidilserina con Anexina V-FITC
analisis citometrico de la funcion plaquetaria8
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

Medida de la expresión de superficie procoagulante:

analisis citometrico de la funcion plaquetaria9
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
  • Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:
  • Objetivos:
  • Detección y cuantificación de fragmentos circulantes de
  • membrana plaquetaria que expresan fosfatidilserina
  • Diferenciar micropartículas activadas y no activadas
  • Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación
  • Aspectos metodológicos:
  • El análisis se efectúa en sangre periférica
  • Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5
  • Medida de fosfatidilserina con Annexina V-FITC
  • Método normalizado en Biocytex
analisis citometrico de la funcion plaquetaria10
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:

Micropartículas plaquetarias

Number of Pathological Samples : n = 22

Test A Test B

CD61/CD41 Annexin V/CD41

Mean 7745 1362

SD 3474 570

Range 1839 - 13620 400 - 2280

Results expressed in number of events / µl whole blood

Micropartículas activadas

ejemplo de analisis citometrico integrado de la funcion plaquetaria
EJEMPLO DE ANALISIS CITOMETRICO INTEGRADO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

ADP

ADP

RBC

Plaquetas

B

C

A

A23187

Basal

A23187

ADP

F

Basal

Basal

ADP

D

E

G