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竞争放射分析

竞争放射分析. 放射免疫分析 （ Radio Immuno Assay, RIA ） 竞争性蛋白结合分析 （ Competitive Protein Binding Assay, CPBA ） 放射受体分析 （ Radio Receptor Assay, RRA ）. 优点： 1 、灵敏度高 3 、应用范围广 2 、特异性强 4 、操作简单 缺点： 1 、生物试剂，稳定性受多因素影响 2 、灵敏度难以超过 ag 水平. 竞争放射分析的原理. *P + Q = （ * P — Q ） + *P

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竞争放射分析

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Presentation Transcript

  1. 竞争放射分析 • 放射免疫分析 （Radio Immuno Assay, RIA） • 竞争性蛋白结合分析 （Competitive Protein Binding Assay, CPBA） • 放射受体分析 （Radio Receptor Assay, RRA）

  2. 优点： 1、灵敏度高 3、应用范围广 2、特异性强 4、操作简单 缺点： 1、生物试剂，稳定性受多因素影响 2、灵敏度难以超过ag水平

  3. 竞争放射分析的原理 • *P + Q =（*P—Q）+*P + P = （P—Q）+P *P：标记物 P ：未标记物 Q ： 特异性结合剂

  4. 放射免疫分析原理 • *Ag+Ag+Ab = （*Ag—Ab）+（Ag—Ab）+*Ag + Ag 0 Max Min    条件：1、 *Ag定量、足量 2、 Ab限量*Ag>Ab 专用符号： 1、T 加入的*Ag的放射性计数 2、B *Ag—Ab免疫复合物的放射性计数 3、B0 Ag=0时*Ag—Ab放射性计数 4、F 游离的*Ag的放射性计数 T=B+F 5、NSB 非特异性结合产生的放射性计数 6、结合率：B/T、B/B0、B/F

  5. 竞争放射分析的三种基本试剂 • 标准品 • 标记物 • 特异性结合剂

  6. 标 准 品 • 化学结构： 应与被测物具有相同的化学结构 • 化学纯度： 纯品 • 化学度量： 准确 • 稳定性： 保持生物活性不变

  7. 标 记 物 • 要求： 1、较高的比活度 2、生物活性与免疫活性：与标记前一致 3、放射化学纯度：>95% 4、稳定性 • 鉴定： 1、最大结合率 2、标准曲线比较法 3、稀释曲线比较法

  8. 特异性结合剂 • 要求： 1、亲和力 2、高滴度 3、特异性 4、可长期保存

  9. 抗 血 清 • 抗原 • 动物选择 • 佐剂 • 免疫动物、收获鉴定抗体

  10. 抗血清的鉴定 • 亲和力： 指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数KA表示。 • 特异性： 抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用 交叉反应率（Cross Reaction）表示 交叉反应率=Y/Z×100% Y：标准抗原取代50%结合率所对应的浓度 Z：类似物取代50%结合率所对应的浓度 交叉反应率测定：以比正常生理浓度高100倍以上的类似物为测定物进行测定，同时观察置换0标准管50时所对应的化学量 • 滴度： 结合50%标记抗原时血清的稀释度

  11. 特点： 特异性高 抗体成分专一 可反复制备 制备： 1、免疫小鼠，制备脾细 胞悬液 2、选择培养，用HAT培 养基筛选杂交瘤细胞 3、检测抗体 4、克隆化 单 克 隆 抗 体

  12. 其它特异性结合剂 • 血浆结合球蛋白 • 受体蛋白

  13. 放射性标记T4与不同特异性结合剂

  14. 结合与游离部分的分离 • 分离方法的要求 1、使结合部分与游离部分尽可能完全 分开 2、分得的成分便于作放射性操作 3、分离效果不受外界干扰因素影响 4、操作简便、分离迅速、重复性好 5、试剂来源广泛、价廉易得

  15. 常用的分离方法 • 双抗体法 • 聚乙二聚法（PEG） • 活性炭吸附法 • 盐析法 • 微孔滤膜法 • SPA法 • 固相抗体法：塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球 • 磁化颗粒法 • 屏蔽计数法

  16. 竞争放射分析方法的建立

  17. 反 应 方 式 • 平衡法 • 顺序加样法 • STAT法

  18. 试 剂 用 量 • 高含量样品： 灵敏度高，B0/T在30—50% • 低含量样品： 高剂量斜率好，B0/T在50—70%

  19. 反 应 介 质 • pH和离子强度 • 反应体积 • 添加剂 • 样品处理

  20. 加 样 程 序 • 实验设计、 • 配制试剂 • 加未标记物（标准品或待测样品） • 加标记物 • 加特异性结合剂 • 混匀、温育 • 加分离剂、分离B与F • 测量各管放射性计数，绘制标准曲线 • 由标准曲线反求出样品浓度

  21. 免 疫 放 射 分 析（Immunoradiometric Assay,IRMA）

  22. IRMA的基本原理 • 单位点系统： Ag + *Ab  (Ag-*Ab) + *Ab ImAd-Ag + *Ab  ImAd-Ag-*Ab

  23. IRMA与RIA的主要区别

  24. IRMA的实验方法 • 单位点系统 • 双位点系统 • 标记第三抗体法 • 双标记抗体法

  25. IRMA的特点 • 标记物的放射性活度高 • 反应达到平衡快 • 比RIA更高的灵敏度 • 比RIA的标准曲线范围更宽 • 比RIA的特异性更高 • 方法稳定性好 • 目前仅能检测大抗原

  26. 数 据 处 理 • 作图法 • 数学模型计算法

  27. 几种数学模型 • 线性内插 • 多项式函数 • 样条函数 • 直线化模型 • Logistic模型 • 四参数

  28. 标准曲线应符合的条件 • B1/B0>85%，Bn/B0<15% • 标准曲线的范围应包括高、中、低三种剂量，正常值范围应在直线部分，应包括临床有意义的部分。 • 曲线应有一定的落差 Bn/B1>3

  29. 标准曲线的质控参数 • B0%：30—70% ，50%最佳 • NSB/T<5%，NSB/B0<10% • 有效剂量：ED25、ED50、ED75 • 直线化后（拟合后）相关指数 r>0.99

  30. 质 量 控 制 • 近期目的： 通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍 • 远期目的： 通过对不同批测定结果的比较，发现造成成误差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高质量

  31. 误差及引起误差的原因 • 试剂 • 加样误差 • 分离误差 • 测量误差 • 数据处理 • 样品的采集与制备

  32. 质量控制指标

  33. 精 密 度 • 用同一实验方法多次检测同一样品所得结果的一致程度和重复性 • 标准差、变异系数、效应误差关系、精密度图

  34. 准 确 度 • 测定值与真值的符合程度 • 用回收试验及平行实验来评价

  35. 灵 敏 度 • 测定方法的最小可测量 • 确定方法： 零标准管法、t值检验法、 粗略估计法

  36. 特 异 性 • 特异性决定于抗体 • 常用交叉反应率表示

  37. 稳 定 性 • 指批间的重复性 • 常用指标： B0%、NSB、ED、r等

  38. 临床有效性 • 与临床的符合程度 • 真阳性率、真阴性率、假阳性率、真阴性率

  39. 内 部 质 控 • 批内质控： • 批间质控：

  40. 外 部 质 控 • 目的： 提高各实验室之间检测结果的可比性 • 方法： 由一个单位提供方案及外部质量平价用的统一样品，分发到各参加单位进行检测，然后将所得结果反馈于负责单位进行整理分析、评价，用以促进检测质量的提高和资料的可比性。

  41. 体外放射分析的误差 室内质控 室间质控 批内质控 批间质控 对某种分析方法、试剂或试剂盒进行综合评价 对不同实验室的分析工作质量进行比较 批内精密度与偏听偏信倚分析 批间精密度与偏听偏信倚分析 向主管部门提供信息，对方法、试剂（盒）进行改进，促进实验室内部的质量控制工作 寻找误差产生的原因、改进分析工作质量

  42. 非放射性标记免疫分析技术 • 酶标记免疫分析法 • 化学发光法 • 时间分辨免疫荧光分析法 • 基因芯片技术

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